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1、体细胞杂交技术的应用,原生质体融合,杂种细胞发育动态及体细胞杂种鉴定,体细胞杂交的概念,第一节 体细胞杂交,一、体细胞杂交的概念,概念：体细胞杂交，即原生质体融合，将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）。几种不同的表述：体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞操作：Cell manip
2、ulation 细胞工程（Cell engineering）,体细胞杂交与有性杂交的异同,+,体细胞杂交,有性杂交,Possible Result of Fusion of Two Genetically Different Protoplasts,=chloroplast,=nucleus,Fusion,heterokaryon,cybrid,cybrid,hybrid,hybrid,=mitochondria,原生质体融合的有关名词-I,对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmic hybrid,Cybr
3、id）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetric fusion）也称标准融合（Standard fusion）非对称融合（asymmetric fusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分,原生质体融合的有关名词-II,供-受体融合：Donor-recipient fusion体配融合（gameto-somatic fusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：Subprotoplast-protoplast fusion 小原生质体：Miniprotoplast 微原生质体：Microprotoplast 胞质体：Cytoplast胞质体-原生质体融
4、合:Cytoplast-protoplast fusion,发展历程,70年代，技术建立和完善优化1972年获得烟草种间体细胞杂种1975年高Ca高pH加PEG融合方法，电融合法大量成功报道，不少为异想天开的实验80年代初，由模式植物转向农作物/经济作物，对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道90年代至今，成为一种育种手段,1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；1
5、974年，Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年，Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃薯）；1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。,植物体细胞杂交的几个重要进展,理论上，任何细胞都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体
6、、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。,根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大方式：对称融合（symmetric fusion）即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（asymmetric fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。,用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂：核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活罗丹明（R6G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。,二、原生质体融合,融合方法,原生
7、质体融合过程,影响原生质体融合的因素,融合方法,PEG融合,电融合,Polyethylene glycol（PEG）Electrofusion,Electrically induced fusion,1.PEG诱导融合法PEG诱导融合的特点：优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。PEG作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果使原生质体发生粘连进而促进原生质体融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原
8、生质体的核、细胞器发生融合成为可能。,融合液：CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol pH 5.6 诱导液：融合液PEG 2045 稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液(g/100ml)pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169,2电融合法 Electrofusion,Electrically induced fusion 与PEG融合相比，电融合有三大优点：不存在对细胞的毒害问题；融合效率高；融合技术操作简便。,Electrofusion:A high fr
9、equency AC field is applied between 2 electrodes immersed in the suspension of protoplasts-this induces charges on the protoplasts and causes them to arrange themselves in lines between the electrodes to form pearl-chain.They are then subject to a high voltage discharge which causes their membranes
10、to fuse where they are in contact.,电融合仪的结构特点：交变电场部分高频直流电击部分,电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。,关于融合参数：交流电压 交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间 直流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数,原生质体的融合过程,膜的融合细胞质融合 发生膜融合后的数小时 核融合
11、融合可能发生在细胞间期，也可能发生在第一次同步分裂过程中,影响原生质体融合的因素,原生质体质量对细胞融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件融合方法融合参数，包括各种融合液都应选择适当,三、杂种细胞的发育动态及体细胞杂种鉴定,杂种细胞的发育动态,杂种细胞选择系统与体细胞杂种植株鉴定,体细胞杂种的特点,体细胞杂种后代的遗传,杂种细胞的发育动态,核融合核重组细胞器重组部分核物质或细胞器丢失核分裂的非同步性,杂种细胞选择系统与杂种植株鉴定,1杂种细胞的选择系统 外观选择：质体、细胞体积等 互补选择：抗生素、营养缺陷型等 荧光标记选择：亲本标记不同荧光,2体细胞杂种鉴定形态鉴定：根
12、据双亲的形态学性状观察进行鉴定。细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定、染色体原位杂交生化鉴定：同功酶鉴定分子鉴定：RFLP、RAPD、SSR等分子标记,形态鉴定和同功酶鉴定,染色体原位杂交GISH、FISH,RAPD标记鉴定,体细胞杂种的遗传,1细胞分裂与染色体丢失 如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中会有两种结果：一是细胞分裂几次后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。减数分裂时染色体配对异常：环形、染色体桥等。,2基因转移与性状表达 由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。基因
13、转移通常在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。,3体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。,4体细胞杂种的核质遗传1）核遗传：双亲之和，少数有重组和丢失2）线粒体遗传：往往有重组，柑橘上例外，仅来自愈伤组织亲本3）叶绿体遗传：随机分离，也有共存现象,四、体细胞杂交技术的应用,获得新物种,获得新种质和新品种,转移细胞质基因控制性状,体细胞杂交技术展望,体细胞杂交技术的应用,克服生殖障碍，创造新种质；转移有益性状，改良作物品质；转移部分染色体，
14、创造非对称杂种；转移胞质基因组，创造胞质杂种；作为育种中间材料（bridge material），进一步用于作物改良。,通过原生质体融合获得的属间体细胞杂种,原生质体融合转移的一些遗传性状,柑橘体细胞杂交策略Strategies for Protoplast Fusion in Citrus Scion+Scion Rootstock+Rootstock Citrus+Other Genera 2X+4X 2X+2X:2X cybrid or asymmetric SH X+2X:seedless 3X(Japan,France),针对柑橘育种实践，我国HZAU已获得40余例柑橘属间、种间体细
15、胞杂种/胞质杂种；典型组合：柑橘+金柑、红桔+枳、柑橘+九里香、柑橘+黄皮、脐橙+葡萄柚、温州蜜柑+杂种柚等；世界共获得250例以上，中国（40）、美国（120）、日本（20）、法国（15）、意大利（5）、西班牙（10）、巴西（15）、以色列（5）等国。,世界柑橘体细胞杂种创造概况,Kobayashi S et al.J Japan Soc Hort Sci,1995,64:283-289,柑橘体细胞杂种的应用,与二倍体有性杂交，培育三倍体；进行二倍体柚瘪籽果实生产；直接作为二倍体、四倍体鲜食品种；砧木育种；基础理论研究的理想材料,以异源四倍体为父本培育三倍体的优点,亲本来源广泛，目前全世界200余例；花粉育性比同源四倍体高；通过倍性杂交获得的三倍体为三亲杂种，遗传基础更为广泛，有利于筛选优质、多抗柑橘类型。,本章思考题,概念：原生质体、原生质体融合/体细胞杂交等有关名词简答题：原生质体培养方法及各自特点？PEG融合与电融合各有何特点？电融合的原理是什么？植物体细胞杂种如何筛选和鉴定？植物体细胞杂种在育种上的应用有哪些？,
