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1、免疫组织化学技术（immunohistochemistry）,概念:指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法,基本原理 通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。,组织抗原,抗体,标记物,标记抗体,1 荧光2 酶3 亲和技术4 金标,组织抗原,免疫细胞化学反应原理：,标记抗体,标记的抗
2、原抗体复合物,间接法,直接法,两种免疫细胞化学反应方法,组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法应用,组织与细胞材料的制备,组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作,切片的制作,组织的固定组织石蜡包埋切片,目的:使细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。,组织材料的固定,影响固定的因素1.温度 一般固定液固定效果随温度升高而加强，以室温22 为常用。2浓度 10中性甲醛，4多聚甲醛固定液3.固定时间 要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓
3、度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。组织固定后，必须彻底冲洗以去除固定液,组织的脱水,脱水就是用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程。不同的组织应分开脱水，特别是对一些易脆的组织（肝、脾等）应严格掌握脱水时间。动物组织的脱水时间应比人体相应标本时间短脱水应按照从低浓度到高浓度的过程。,组织的透明、浸蜡、包埋,组织透明的目的是便于浸腊包埋组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水不良以及透明剂的纯度不够。最常用的透明剂为二甲苯浸蜡包埋是使蜡进入到组织中使其变硬便于切片。蜡的熔点一般为56-58。包埋蜡的温度应与组织块温度接近。,大组织：75乙醇301
4、20min，85乙醇30120min，95乙醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇过夜，无水乙醇30 60min，无水乙醇3060min，无水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可视观察结果而定），石蜡30min,石蜡12h，石蜡23h。小组织：75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h、1h、过夜或2h，无水乙醇、和各30min，二甲苯15min、10min、10min（肉眼观察），石蜡30min，石蜡30min，石蜡12h。,组织石蜡包埋,切 片,载玻片的清洁：清洁液浸泡24小时后依次自来水、双蒸馏水洗，95%酒精浸泡2小时，擦拭干净。如需开展原位杂交，还需将玻片24
5、0烤2h。切片粘合剂的使用：多聚赖氨酸（分子量200KD）：0.05%浓度，浸泡5分钟，60烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥备用。,切片：石蜡切片：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)60烤片3-8h。(3)切片厚24m。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4保存数年 冰冻切片：,细胞爬片制作,将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。,细胞涂片制作,离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗23遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取3050ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂
6、抹均匀。待稍微风干以后加4多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定24小时。在细胞上加一层甘油放-20保存。,抗原暴露和修复,石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定剂甲醛使蛋白质发生凝固,在发生凝固的过程中可引起自身和不同蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联,导致蛋白质三级或四级结构的折叠方向发生改变,并形成网络状结构而掩盖抗原决定蔟。染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要抗原暴露和修复，可使抗原决定簇重新裸露。抗原暴露和修复常用方法有二种,一是用酶消化,二是用热处理(微波辐射法、高压法及隔水加热法),直接加热法 最常用,操作方法是将介质溶液用烧杯在电炉上加热至100,放入切片并保持9
7、510020min,在室温中自然冷却20min即可。热修复热介质 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液,最常用。,微波辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟。待修复液自然降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。,高压抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续14分钟。待修复液自然或冷水冲洗恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免
8、疫组织化学染色方法进行染色。,隔水热抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92）。即开始计时，持续40分钟。待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。,胃蛋白酶消化法：主要用于细胞间质抗原的检测,如纤维蛋白及各类胶原的现示。使用工作浓度为0.4。配制方法:称取400mg胃蛋白酶加入到100ml 0.01mol/L HCl中,组织切片在37消化3060min。,胰蛋白酶消化法
9、：最常用,主要用于细胞内抗原的检测。使用工作浓度为0.050.1。配制方法:称取0.05g或0.1g胰蛋白酶及0.1g无水氯化钙,加入到100ml蒸溜水中,待溶解后用0.1mol/L NaOH调PH值至7.6。组织切片在37消化1040min。,蛋白酶K消化法,主要用于原位杂交前标本的处理,常用的工作浓度为0.025mg/ml(25ug/ml)。配制方法:称取0.025mg蛋白酶K加入到1mlPK缓冲液中。(PK缓冲液:1mol/L PH8.0的Tris-Hcl 10ml;0.5mol/L EDTA 10ml;双蒸水80ml,三液充分混合即可)。,组织切片中内源性酶的阻断,内源性过氧化物酶主要
10、存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法：最常用0.3%0.5%H2O2-甲醇液，作用1530min，阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性（使特异性着色减弱），而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。,免疫染色,标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）,免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。,免疫组织化学方法,荧光标记免疫组织化学,酶联免疫组织化学,荧光标记免疫组织化学,
11、直接法 间接法,免疫荧光技术将 荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位,免疫荧光技术,.异硫氰酸荧光素 FITC.四乙基罗达明.四甲基异硫氰酸罗达明.藻红蛋白 呈现不同的荧光：绿色荧光(FITC)橙色荧光 橙红色荧光 红色荧光等,荧光素 作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物,荧 光：在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失 荧光显微镜：荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检标本内的荧光物质发出发射光,海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突)轴突终末蛋白
12、红色(突触),培养的成纤维细胞 微管呈绿色 核呈蓝色,免疫酶组织化学,酶标记抗体法非标记抗体免疫酶法多聚螯合物酶法,酶标记抗体法,是用结合物将酶标记（共价键或非共价键方法结合）在抗体分子上，通过抗原-抗体反应使抗原-抗体复合物上带有酶分子，再借助酶对底物的特异性催化作用，在抗原-抗体反应部位形成不溶性有色产物，在显微镜下观察组织中抗原的性质和分布。可用作标记抗体的酶有多种，但最常用的为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）其方法可分直接法和间接法两种。直接法直接法是将酶（如HRP）直接标记在特异性抗
13、体上，然后与组织中的相应抗原相结合，形成抗原-抗体-HRP复合物，最后进行显色。,间接法,间接法也称夹心法，是将酶标记在第二抗体上（第二抗体为抗第一抗体的抗体），形成抗原-第一抗体-第二抗体-HRP复合物，然后进行显色。该法要求第二抗体与第一抗体应是不同种属的动物产物。间接法应用广泛，只需标记一种二抗就可以检测众多相同种属来源的一抗。,免疫组化SP法的基本步骤,（1）石蜡切片脱蜡至水。（2）抗原修复（3）3%H2O2室温孵育510min，以消除内源性过氧化物酶的活性。（4）蒸馏水冲洗，PBS洗。（5）5%10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释
14、的第一抗体或即用型第一抗体，37孵育2h或4过夜。（6）PBS冲洗，5min3次。（7）滴加适当比例稀释的二抗，37或室温孵育1030min。（8）PBS冲洗，5min3次。（9）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）或辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育1030min。（10）PBS冲洗，5min3次。（11）显色剂显色（DAB或AEC）。（12）自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树胶封片。,2、非标记抗体免疫酶法,在酶标记抗体过程中可降低部分抗体和酶的活性，使得抗体的效价降低。另外，血清中的非特异性抗体也可被酶标记，引起非特异性背景。非标记抗体免
15、疫酶法是先用酶（HRP或AKP）去免疫动物，使其产生抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如PAP（HRP）、APAAP（AKP）等复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键标记，保留了免疫活性，因此敏感性大大提高。非标记抗体免疫酶常用的有酶桥法，辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶复合物（peroxidase antiperoxidase complex method,PAP）法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）法。,3多聚螯合物酶法,该法是以高分子葡聚糖多聚化合物或氨基酸为骨架与抗体结合，将抗体（一抗或二抗）与HRP结合在一起，形成葡聚糖+HRP+抗体的巨大复合物，然后
16、通过酶的底物进行显色。该法简便、敏感性高。其方法包括EPOS法（enhanced polymer one-step staining）、EnVision法（又称为ELPS法 enhance labelled polymer system）、UIP法、Power Vision法。,EnVision法,是通过葡聚糖将酶与二抗结合，形成酶-多聚化合物（葡聚糖）-第二抗体巨大复合物。每个复合物中含有约70个分子的HRP和10个分子的第二抗体。因复合物的HRP绝对数是远高于其他复合物，故具有高度的放大效果。流程为抗原+第一抗体+第二抗体（标记有葡聚糖合酶）通过底物显色。,EnVision法步骤,石蜡切片
17、至水，PBS洗酶消化或热处理，作抗原修复3%H2O2 甲醇液阻断内源性过氧化物酶10-20minPBS洗5min3次滴加一抗37 60min或4过夜PBS洗5min3次滴加EnVision复合物30min(湿盒内室温或37)PBS洗5min3次DAB显色水洗复染，常规封片,免疫组化结果的判断,免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。,阳性反应的染色特征,阳性反应染色分布有四种类型：细胞间质、胞浆、细胞核、细胞膜表面。阳性细胞分布呈灶性和弥漫性。由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性细胞染色定位于单个细胞，且
18、与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。,注意事项,一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在 4 冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4 冰箱内 可保存半年左右。PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。,二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘 的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。,三、出现假阴性的原因 固
19、定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。抗体浓度过低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH值不正确。,四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。,免疫组织化学技术操作过程中的注意事项：,新购置的抗体需做预实验，一是摸索一抗的最低工作浓度，如厂家提供的说明书上建议工作浓度为1：100，应设1：50，1：100，1：200进行预实验，二是观察一下该抗体的质量，是否有阳性表达，有些抗体在制作、运输、放置等过程中会使抗体效价减低或失活。免疫组织化学操作以手工为主，由于试剂（如缓冲液、显
20、色液、封闭液等）时间、温度的不同会出现不同的结果（常见的为阳性强度、背景及衬染的深度）影响结果的分析。因此，每批实验标本应一次性操作完毕，否则会失去每组（实验组别）之间的可比性。从滴加一抗以后每个步骤切片均不能干涸，否则会出现假阳性或整张切片均呈阳性色。有些抗体，修复抗原时间不宜过度，否则会出现假阳性，如存在胞浆内的抗原在核内出现阳性表达，或定位于核内的蛋白会出现胞浆阳性，这种现象原因很多，抗体不纯也可能是一种原因，但也有一些可能目前还没有发现的原因。每次实验需设阳性对照和阴性对照，阳性对照是将明确含有所测抗原的切片与待检切片同时进行操作，其目的是排除假阴性。阴性对照包括阴性组织对照，阴性试剂
21、对照，阴性组织对照是将已明确无所测抗原的切片与待检切片同时操作，阴性试剂对照，即对照片以PBS或血清代替一抗，其它均与待检切片同步进行。其目的是排除假阳性。每次实验需做操作步骤记录，以便在实验出现失败时便于对失败原因的分析。,免疫组织化学技术的应用,荧光免疫组织化学技术主要用于病原体感染的早期诊断，自身抗体检测，分析淋巴细胞表面标记物质及抗原、抗体的免疫组化定位等；在病原生物学方面，主要用于菌种的坚定和抗原结构的分析；在细胞免疫学检测中，用以检测淋巴细胞表面的各种CD抗原、免疫球蛋白受体、HLA抗原和各种膜受体等。酶免疫组织化学技术主要用于组织切片或其它抗原的定位检测。组织切片中的各类抗原性物
22、质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。免疫标记电镜技术由于需要电子显微镜，目前仍较多用于科研分析。,免疫组化在临床病理诊断中的应用,标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度;协助肿瘤良恶性的诊断;鉴别低分化癌和肉瘤;鉴别转移癌的性质;协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶;鉴别小细胞恶性肿瘤;癌组织耐药基因的检测;为癌症患者治疗方案的拟定提供依据;确定肿瘤组织的增殖活性;评估癌症患者的预后;检测病原体。,鉴别低分化癌和低分化肉瘤,鉴别低分化癌和恶性淋巴瘤 鉴别微小转移癌灶 鉴别某些转移癌的类型 鉴别低分化癌的类型 鉴别低分化肉瘤的类型,Thank You!,
