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1、6 分光光度技术,6.1 基本原理 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术。使用的仪器称为分光光度计。其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。,紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm400nm。可见光区为400nm800nm。,若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D
2、”）或透射程度（透光度“T”），以波长作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A”或“T”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。,2.光吸收定律：朗伯比尔（Lambertbeer）光吸收定律：AlgTb c A吸光度，又称光密度“O.D”。T透光度，TI/I。，I。为照射到 吸收池上的光强，I为透过吸收池的 光强。摩尔吸光系数或克分子吸光系数（Lmol1cm1）。b样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸 收池，b=1cm。c样品浓度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A与
3、物质的吸光系数“”和物质的浓度“c”成正比。,摩尔吸光系数：=A/bc，是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高，值大，说明电子跃迁的几率大。通常 10105：一般认为：104为强吸收；103104 为较强吸收；102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A0.001,所以，当 b1cm,105 时，可检测的溶液最小浓度是 C10-8 mol/L。,常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%（W/V），液层厚度 b1cm 时的吸光度，以 E1%max 表示。吸光度“A”有一个重要性
4、质是其具有加和性：A1C1b12C2b23C3b3 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。,分光光度计的组成和构造：组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。光源 单色器 样品室 检测放大系统 显示器,我系2000年购买的德国耶拿（蔡司）公司生产的SPECORD 200型高档紫外/可见光分光光度计.如下图：,SPECORD 200分光光度计的样品和参比光路，分别有各自的
5、带温控的光电二极管检测器，即为“双检测器”，其波长范围是190nm1100nm，吸光度测定范围是03A，可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm，仪器使用微机控制时，扫描速度最高可达6000nm/min，宽大的样品室可以安装各种附件，仪器性能优良，适合教学、科研使用。,构造：光源：理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是3201100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方
6、倍，因此电源电压必须稳定。用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波长范围是195400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时，其特征谱线是486nm、656nm，用于校正分光光度计的光谱。,单色器：单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：入射狭缝限制杂散光进入。色散元件即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。准直镜把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。出射狭缝只让额定波长的光射出单色器。转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出
7、射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅，它又可分为平面反射光栅和凹面反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝，得到锐线光谱。,狭缝、光谱频带宽度和分辨率：出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽。纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的“单
8、色光”，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为0.1nm。光谱有效频带宽度“b”是检测器检测到的光能量为峰值一半处的二点间的波长间隔，如下图所示：,光强度 Pb=b/(ds d)1/2hb 光谱有效频带宽（nm）b b 狭缝宽度（mm）1/2h ds/d 线色散率 d波长差 波长 dS出射狭缝平面上二条 光线（d）所分开 的距离（mm）由上式可以看出，b与 b 成正比，与线色散率成反比。线色散率越大，则可得到的有
9、效频带宽度越小。,分辨率：是仪器对相邻的两个峰可分辨的最小波长间隔，是仪器分辨邻近二条谱线的能力。狭缝宽度 b 越小，光谱带宽 b 越小，分辨率就越高。,样品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05。吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光，是最常使用的吸收池，使用波长范围是1
10、80nm3000nm。吸收池的形状有长方形，方形和园筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml），光程要求极精确，透光的玻璃面要严格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭头“”，标明杯子使用时的透光方向，反方向使用会有偏差。有各种用途的石英吸收池：如液体池、气体池、微量池（容积5l1ml）、流动池（测量连续流动的样品）、长光径池（测量稀溶液用）、可装拆池（便于清洗）等。石英杯通常还配有玻璃或塑料盖，用以防止样品挥发和氧化，以及杯内样品的快速混合。,检测器：检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。光电管：光电管可
11、检测10微微安（10-11A）的光电流，管内抽真空充入惰性气体，常用国产真空光电管有GD-5兰敏光电管（适用波长为210625nm）；GD-6红敏光电管（适用波长为6251000nm）。751型分光光度计即使用这两只光电管。光电倍增管：它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍，光电子由阴极到阳极重复发射9次以上，每一个光电子最后可产生106107个电子，因此总放大倍数可达106107倍，光电倍增管的响应时间极短，能检测10-810-9秒级的脉冲光。其灵敏度与光电管一样受到暗电流的限制，暗电流主要来自阴极发射的热电子和电极间的漏电。光电二极管：其原理是这种硅二极管受紫外
12、近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强或正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。,尤其值得注意的是由于计算机技术的飞速发展，使用光电二极管的二极管阵列分光光度计有了很大的发展，二极管数目已达1024个，大大提高了分辨率。这种新型分光光度计的特点是“后分光”，即氘灯发射的光经透镜聚焦后穿过样品吸收池，经全息光栅色散后被二极管阵列的各个二极管接收，信号由计算机进行处理和存储，因而扫描速度极快，约10ms就可完成全波段扫描，绘出吸光度、波长和时间的三维立体色谱图，可以最方便快速地得到任一波长的吸收数据，它最适宜用于动力学测定，也是高效液相色谱仪最理想的检测器。本实验室的 SPECORD 1100 就是可见光二极管阵列分光光度计，共256个光电二极管。光栅 钨灯 聚光镜 吸收池 二极管阵列,
