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1、第十一章 分子发光分析法,一、分子荧光与磷光产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure四、影响荧光强度的因素factor influenced fluorescence,第一节 分子荧光与磷光,molecular luminescenceanalysis,mo
2、lecular fluorescence and phosphorescence,一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence,由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、电子激发三重态
3、 T1、T2；,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；,S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；,2.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；,非辐射能量传递过
4、程(去活化过程）,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光；10-710-9 s
5、。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2 2 1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。,二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum,荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定第二单色器的波长(选最大发射波长),使测定的荧光(磷光)波长保持不变，然后改变第一单色器的波长扫
6、描，以测定出的相对荧光(磷光)强度为纵坐标，以相应的激发光波长为横坐标作图，所绘出的曲线就是该荧光(磷光)物质的激发光谱。（图中曲线I）。,激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；,2.荧光光谱(或磷光光谱),固定第一单色器波长(选最大激发波长)，使激发光波长和强度保持不变，然后改变第二单色器波长，进行扫描，得到化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。,3.激发光谱与发射光谱的关系,a.斯托克斯（Stokes）位移 发射光谱（荧光）的波长比激发光谱的长。原因：振动弛豫和内转换去活过程消耗了部分激发能；辐射跃迁可能使激发分子下降到基态的不同振
7、动能级，然后通过振动弛豫进一步损失；溶剂与激发态分子发生碰撞导致能量损失。b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2)。c.镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,
8、蒽的激发光谱和荧光光谱,三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；,2.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有
9、相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。P348,（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。,四、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure,影响荧光强度的外部因素(P350)1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，振动弛豫和外转换的几率增加。因此，采用低温荧光分析法。3.溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,4.各种散射光的影响,溶剂产生的与激发波长有关的散射光，如瑞利散射拉曼光散
10、射。荧光发射波长与激发波长无关，只要改变激发光的波长就可避免散射挂光的干扰。,5.激发光照射的影响,有些荧光物质的稀溶液在激发光的照射下容易发生分解，引起荧光强度的急剧降低。所谓光分解作用，即物质受到光线照射后，所吸收的能量使分子内的一个或几个键发生断裂，使该物质分解。最好采用强度较低的激发光，同时缩短测定时间。,6.溶液荧光的猝灭,荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消失的现象称为荧光淬灭。能引起荧光淬灭的物质称为淬灭剂。碰撞猝灭，单重激发态的荧光分子与猝灭剂碰撞后，以无辐射跃迁返回基态，引起荧光强度下降。猝灭剂分子与荧光分子发生作用，形成配合物或发生电子转移反应。,
11、2023/7/10,7.重原子效应,荧光分子的芳环上被F，Cl，Br，I取代后，使系间窜跃加强，其荧光强度随卤素相对原子质量的增加而减弱，磷光相应增强，这种效应称为重原子效应。,第十一章 分子发光分析法,一、仪器与结构流程instrument and general process 二、荧光分析法和应用fluorescence analysis and application三、磷光分析法的应用phosphorescence analysis and application,第二节 分子荧光与磷光分析法,molecular luminescenceanalysis,molecular fluo
12、rescence and phosphorescence analysis,一、仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；荧光计采用滤光片，荧光分光光度计采用光栅；光源：滤光片荧光计采用高压高压汞灯，荧光分光光度计采用高压氙灯；试样池：低荧光的石英材质做成的方形或长方形池体；检测器：光电倍增管。,磷光检测,荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。P353,测量方法：（1）通常借助于荧光
13、和磷光寿命的差别（磷光比荧光寿命长），采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。,二、荧光分析方法与应用,1.特点（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高23个数量级；为什么？当荧光物质溶液的浓度c一定时，对吸光光度法：吸光度A=KcL=-lgI/I0,增加I0,I也增加，I/I0基本不变化，A基本恒定。而对于荧光分析：If=2.3 I0 b c，增加I0，相对荧光强度If 会大幅度增加。所以荧光分析法的灵敏度要比吸光光度法高23个数量级。检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选
14、择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少 缺点：应用范围小。,2.定量依据与方法,(1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia 由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-b c)If=I0(1-10-b c)=I0(1-e-2.3bc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 b c=Kc,（2）定量方法,标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；,3.荧光分析法的应用,(1)无机化合物的分析 与有
15、机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析 见表,三、磷光分析法的应用,1.稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.药物分析和临床分析 见表,第十一章 分子发光分析法,一、基本原理principle 二、
16、化学发光分析的特点characteristics三 装置与技术instrument and technology,第三节 化学发光分析法,molecular luminescenceanalysis,chemiluminescenceanalysis,一、基本原理 principle,1.化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应
17、持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,2.化学与生物发光分析的应用,（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；（3）间接测定某些生物试样,氨基酸+O2 酮酸+NH3+H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,生物发光分析应用,烟酰胺腺嘌呤二
18、核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：,NADH+FMA+H+NAD+FMNH2,NADH脱氢酶,FMNH2+RCHO+O2 FMN+RCOOH+H2O+h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,二、特点 characteristics,1.灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,
