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1、实验三 常用培养基的制备、灭菌与消毒,实验目的：1.了解培养基的配制原理 2.掌握配制培养基的一般方法和步骤 培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质原则：目的明确;营养协调;控制PH、渗透压等条件;经济节约方法：查阅文献;精心设计;试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查,培养基种类:碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水一、按成份的不同划分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态划分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途划分 基础培养基、加富培养基、鉴别培养基、选择培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,
2、牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂1520g，水1000mL，PH7.07.2(后调),高氏1号培养基,高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂1520g，水1000mL，pH7.47.6。,查氏合成培养基,查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的培养基,其配方如下：NaNO3 3g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4.7H2O 0
3、.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g,H2O 1000ml,pH自然,麦芽汁培养基,用来培养酵母菌,干麦芽粉加4倍水,在50-60保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止,调整糖液浓度,煮沸后，过滤，调pH为6.0。,消毒与灭菌消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加热、过滤、辐射化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。,加热法：干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、热空气灭菌利用高温干
4、燥空气（160170C）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。3、注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度控制在180；3）物品不能太挤；4）温度降至70时才开箱门。,湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法：1、设备：高压灭菌锅2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。4、注意事项：1）冷空气彻底排除；2）加水；3
5、）压力降为“0”时方可打开。,在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表2,常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间1015min，超高温杀菌 135-150C和2-8s对牛乳和其它液态食品灭菌。优点：保持食品价值和营养成分。,过滤除菌：原理：介质在有压力时阻隔微生物。适用范围：许多材料如血清
6、、抗生素及糖溶液采用此法。设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。注意事项：1、压力适当；2、无菌条件下进行；3、防止渗透现象。,辐射灭菌：原理：紫外线波长在200300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。应用：无菌室，医院。注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。,化学药品灭菌：原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微 生物所处的环境有关。常
7、用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸 福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等,分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种 或某一株微生物的过程。为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保 证是一种菌。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法、稀释涂布平板法 稀释混合平板法、平板划线法,实验四 微生物的分离、纯化及培养技术,稀释涂布平板法：步骤：1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏培养基冷却至55-60时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有
8、4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28培养箱中培养3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37培养1-2days。5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。,平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法 稀释混合平板法：1、先加菌2、倒平板时注意培养基温度3、混合均匀,微生物培养技术1、斜面接种2、液体培养基接种3、穿刺接种将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培
9、养箱中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置4冰箱中保存。,观察菌落形态并记录,序号 来源 大小 形状 边缘 颜色 表面 代谢物 种类,实验五：放线菌及霉菌形态观察,目的要求1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。,原理,放线菌是一群丝状，G+的细菌，在气生菌丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pH与细菌相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。其DNA 碱基组成中GC含量特别高。超过任何已知的细菌。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。,放线菌(Actinomycetes),分生孢子丝,琼脂表面,基内菌丝,气生菌丝,
10、The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）,分生孢子丝,琼脂表面,基内菌丝,气生菌丝,The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）
11、,放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。,链霉菌的各种孢子丝结构,链霉菌的分离：pH中性偏碱 喜干（含水少）采用含各种无机盐的选择性培养基,已知放线菌能够产生500多种抗生素。大多数抗生素对不同的细菌有独特的疗效有50多种被实际应用,放线菌Actinomycetes,霉菌(molds),是丝状真菌的总称,即“
12、发霉的真菌”。通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下大量生长繁殖。,形态特征（Morphological characteristics）,属异养型真核生物，具有丝状或管状结构，单个分支称为菌丝。菌丝形成的网络状结构称为菌丝体。营养菌丝（vegetative mycelium）：汲取营养气生菌丝（aerial mycelium）繁殖菌丝:孢子丝，进行繁殖。,分类（classification）,有隔菌丝：有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，在菌丝生长过程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂，每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之间的物质相互沟通。如曲霉和青霉
13、。无隔菌丝：菌丝中无横膈膜，整个细胞是一个单细胞，菌丝内有许多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质体质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。,nonseptate,(2)septate,繁殖方式,无性繁殖：芽生孢子节孢子孢囊孢子后垣孢子分生孢子有性繁殖：卵孢子接合孢子子囊孢子,Sporangiospores,孢囊孢子（Sporangiospores are formed within a sporangium）,节孢子Arthrospores,分生孢子Conidiospores,卵孢子（Oospores）,antheridium,oospheres,oospores,oogonium,O
14、ospores formation,接合孢子 Zygospores,接合孢子形成过程,子囊孢子 Ascospores,几种常见霉菌,根霉,根霉的形态结构,曲霉,曲霉的形态结构左侧分生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具 有二层小梗,青霉,青霉的形态结构 A单轮型 B非对称型 C对称二轮型,实验内容,人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌和霉菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。,插片法:倒平板插片接种培养镜检记录绘图 压印法:倒平板划线接种挑取菌落加盖玻片镜检记录绘图 埋片法:倒琼脂切槽接种培养镜检记录绘图,倒平板 将培养基熔化后，倒10-12毫升左右于
15、灭菌培养皿内，凝固后使用.插片 将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3。接种与培养 用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28培养37天。观察 培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。,关键步骤及注意事项,倒平板要厚一些，接种时划线要密。插片时要有一定角度并与划线垂直。观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。,思考题,镜检时，你如何区分放线菌的基内菌
16、丝和气生菌丝?你认为霉菌和放线菌菌丝的主要区别是什么？,实验六、菌种保藏,几种常用的保藏方法：1、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。2、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。,3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。此法关键是要克服细胞的冷冻损伤
17、。注意控制降温速率及保护剂的使用。5、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和L干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在1020C范围内进行真空干燥。,操作方法 1、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存24个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。,2、液体石蜡保藏法 将
18、无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通细菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4冰箱存放。,4、砂土管保藏法（1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒
19、部分丢掉。(3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10 x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，最后烘干。,(4)无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使用。(5)菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。(6)分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入05ml菌悬
20、液(刚刚使砂土润湿为宜)，用接种针拌匀。(7)干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。(8)保存 置4冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。,5、冷冻真空干燥法（1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。（2）菌种培养：细菌芽孢脱落；放，霉孢子丰满。（3）保护剂的配制：配制，灭菌，检查（4）菌悬液的制备：2-3ml保护剂（5）分装样品：菌悬液每管0.2ml（6）预冻：程序控温仪降温（7）冷冻真空干燥：-50下抽真空（8）取出样品：轻敲松散即达标（9）第二次干燥：（10）熔封（11）存活性检测：抽取一管进行存活性检查(12）保存：4保存,
