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1、,制备HPLC技术,主要内容,第一部分.制备HPLC概述第二部分.制备HPLC技术问题 上样 条件的选择 馏分的收集 循环色谱 柱切换,第一部分制备HPLC概述,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。,制备HPLC概述,制备HPLC概述制备HPLC与 分析HPL比较,制备HPLC概述主要结构单元,输液部:输液泵 shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备)分离部:制备柱内径2050mm，柱长50cm。检测部:检测器 shimadzu SPD-M10Avp馏分部:馏分收集器 shimadzu FRC-10A,制备HPLC概述制备
2、泵的耐压,制备HPLC系统因制备柱的填料很细，分离度好，同时反压很高，整个系统对压力很敏感，制备泵要求能在制定的恒流量下,克服100-150 bars反压,色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,制备HPLC概述柱容量,制备HPLC概述分离效能,取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个分离参数进行优化常会影响到其他分离参数。,增加洗脱液流速会降低分辨率，分辨率也会因上样量过大而下降。但分辨能力并不总是制备HPLC首要考虑的因
3、素，制备型HPLC应首先具有经济、快速的生产所需产品的能力。,制备HPLC概述应用举例,在许多分离工作中，需要从大量的物质中分离纯化不足的所需成分，这种分离工作十分困难，在纯化的最后阶段常需使用m或更小颗粒的高效填料。为获得所需微量组分，可采用如下手段：制备型分离-半制备型分离-分析型分离-产物。,制备HPLC有关技术问题,第二部分,制备HPLC技术问题超量载样,在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1：100000，进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1：100)。在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。而在制备液相中，最大的区
4、别就是超量进样。,制备HPLC采用超量进样的原因:,大样品量的纯化方法,分析系统的放大:使用直径更大的制备柱、更高的流速，根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变，峰形尖锐而对称。需大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，不经济,色谱柱超量载样：相同的条件下超量进样,制备HPLC技术问题超量载样,浓缩法超量载样,体积法超量载样,VS,制备HPLC技术问题超量载样,注意!,应尽可能选用流动相来溶解样品，但应注意样品在流动相中应有良好的溶解度。同时，若样品体积太大，分辨能力就会下降；若样品过浓，则可能在柱的顶部形成沉淀。尽管如此，为每次可分离得到更多的样品，还是应在小体积的流动相中溶解较多的
5、样品。可将样品溶于不同于流动相的溶剂，但用此法时需很谨慎。,制备HPLC技术问题超量载样,分析HPLC进样量远远小于柱子的载样极限,样品在柱子里的分配几乎是理想的,而制备通常都会对上样到一定的过载,主要组分的量在柱子里分配已经和分析情况很不相同,通常在增加到一定进样量后,分离效果都会不同程度的变差！,制备HPLC的首要问题是快速、高效的制备色谱纯的产品！,分离度在制备HPLC中并不是首先要关注的问题，色谱峰会比较难看！,制备HPLC技术问题样品的纯化,在利用制备HPLC最终纯化步骤前做一些初步纯化是提高效率降低成本的优化措施.比如最终纯化通常有一定的分离难度,又希望有足够的收率,所以使用的仪器
6、和填料可能是昂贵的.未经预纯化的样品,尤其是天然产物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附的组分,直接进样,可导致昂贵的填料很快失效.此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了进样量和生产效率.同时分别用正反相色谱去除前后杂,比单用一种色谱得到目标产物更简单易行.总之,制备色谱尤其是工业色谱的目标不仅是找到技术上可行的方法,而且要综合考虑成本.,制备HPLC技术问题应用举例,样品如果溶解度太低如何上制备？,在制备系统溶剂中，样品如果溶解度太低，估计0.05mg/ml，该如何处理？（70甲醇水）不可能为了50mg 而上1000ml溶液吧？如果用纯甲醇做溶剂，会导致样品析出，如果用纯甲醇做流动
7、相，那柱子根本无保留！,问题,样品可能某种晶型难溶，这样可以加入其他溶剂（如丙酮等）以助溶 如果不是蛋白质等大分子，试一下DMSO或DMF加入少量二氯甲烷，也有助于改善样品的溶解性 对溶解不好的小极性分子更常用的是THF/H2O 流动相是甲醇：水：。应该能用甲醇溶样。因为流动相很快，能很快稀释样品溶液 另外,制备HPLC技术问题应用举例,可以采用预装柱形式：先将样品和少量填料（粉）混合，搅拌均匀，然后将此部分硅胶装到一小柱内。在洗脱时，先让洗脱液通过此小柱，然后在上分离柱（干法上样）。此方法对不溶性样品或不能用溶剂溶解的样品很有效，同时分离效果也会提高,用正相色谱比用反相色谱更适合这个样品。一
8、是解决了溶解的问题。二是分离度方面有意想不到的收获。,如果多肽类，调一下PH值常常会得到很满意的效果,首先如果调节PH值可以溶最好，不行用甲醇乙腈，DMSO，THF，最好每次只加一种溶剂 试溶,注意！,固体上样,制备HPLC技术问题应用举例,如果样品溶解在高比例甲醇中，上样体积一定要小，否则就会不保留原因是大量强极性的样品溶剂破坏了柱平衡有时会看到陡的前沿和长拖尾甚至同一样品出两个峰,DMSO可能对柱子不是很好,顺序也很重要，比如，先加水再加甲醇不溶，先加甲醇再加水就溶了,用二氯甲烷可能的问题是不混溶,注意问题,上样量的调整：mp/ma=lp/la*r2p/r2aL:柱长；m：进样量；r：色谱
9、柱内径 p:制备柱；a：分析柱,制备HPLC技术问题上样量的选择,上样量主要根据a、柱子的大小b、样品的浓度c、制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填料）,根据内径计算：内径放大N倍，进样量大致可放大N平方倍（柱长一定时）,将分析色谱上的结果放大到制备色谱中：,制备HPLC技术问题条件的选择,通常采用将分析HPLC上的条件进行优化、放大后应用到制备HPLC中。,然而，分析和制备是不同的概念，如果用分析的条件（上样量，流动相消耗量）等条件简单的放大，成本会很高。制备的首要概念是在达到纯化的基础上，降低成本，加快时间（提高效率）。,制备HPLC技术问题条件的选择,浓缩法超量载样和体积
10、法超量载样都会导致组份溶解性的降低。既然组分的分离需要一定的溶解性，那么在放大分析方法的时候，优化溶解性、特别是选择性就是一项很重要的工作。因为选择性和超量载样潜力是相互依靠的，选择性的提高会提高一次运行中所分离的样品量。,选择性与超量载样,制备HPLC技术问题条件的选择,从分析方法到制备方法的放大和方法的优化需要三个步骤：1.优化分析方法的选择性。2.在分析柱上进行超量载样。3.放大到制备柱。,制备HPLC技术问题条件的选择,制备HPLC技术问题条件的选择,线形放大,非线形放大,指柱直径、长度（即柱体积）和流速等可以根据加样量的增加情况进行按比例线形放大。制备色谱中，最好的线形放大是在其他工
11、艺条件不变的情况下，只改变柱子和流速，就可以放大生产，同时分离效果保持不变。成本比较大，同时也大大减少生产的产量和速度,制备HPLC技术问题条件的优化,流速的调整：Fp/Fa=Vp/Va=Lp/La*r2p/r2aF：流速；V:柱体积；L:柱长；r：色谱柱内径；p:制备柱；a：分析柱,注：流速一般为分析流速线性放大量的40%50%最好,制备HPLC技术问题条件的优化,梯度的调整tp/ta=Vp/Va*Fp/FaF：流速；V:柱体积；t:梯度洗脱时间；p:制备柱；a：分析柱,制备HPLC技术问题条件的优化,从分析到制备转化，分析时应尽量分得开。一般情况下，放大由加样量变化决定。可以根据加样量增加
12、对柱子体积（直径和长度）和流速进行线形调整。,小结,制备HPLC技术问题条件的优化,尽可能正相制备用正相分析柱摸条件,反相制备用反相分析摸条件,包括流动相的选择性,基于分析柱上的条件及得到的相应分离度可以大致判断出初步的制备条件,如制备填料粒径,柱长,洗脱条件(需要考虑到经济性).这些条件是初步的,此后需要做大量的优化工作.,制备HPLC技术问题条件的优化,如果推算条件适当,小进样量条件下在制备柱上应该得到较好的分离,在这个基础上优化洗脱条件,然后逐步增加进样体积,试验得到柱子能承受的最大进样体积,然后在最大进样体积下提高浓度,试验得到柱子能承受的最大浓度.这里还有优化方向的选择,比如是追求最
13、大单次纯品回收率还是追求最大单次纯品产量,方向不同,最佳条件就会不同.,制备HPLC技术问题条件的优化,基于分析和制备的不同目的，色谱方案是有很大差异的，但为了在分析柱上摸索制备条件，就不能单纯地以分析的思路去执行,结论,制备HPLC技术问题条件的优化,1）制备的目的是在一次操作中尽可能地多上样，所以，首先得在分析柱上实现超载，否则，分析柱分离得再漂亮，再在制备柱中线性放大时就因为成本不合理而被无情地否决。2）制备的目的是分离你所关心的组分，只要它能与其它杂质分离的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有组分的基线分离，完全没有必要！设计梯度时只需对目的物前后5-10%梯度的范围进行精细分离
14、。,制备HPLC技术问题条件的优化,3）制备中常常因为超载而无法使目的物与邻近杂质间达到基线分离，可以采用分段收集的方法得到指定纯度的目的物，要求越纯，单次操作的得率也越低。4）制备中因为目的物来之不易，常常需要将纯度不合格得目的物重新上柱循环，一般只需稀释1-2倍就可以了。由于重新上柱是会增加成本的，所以超载的量要平衡单次操作的纯品得量和效益与返工成本，以单位纯品数量进行成本核算，以优化最佳上样量。,制备HPLC技术问题问题解答,同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套，分离度会不会变化？,一般会有一定的变化，原因有以下几点（1）制备柱的装填是否均匀，如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的
15、经过通道的直径不同、阻力不一样，停留时间不同，色谱峰可能变宽。（2）如果样品在流动相中溶解度小，在制备色谱上会有不同的峰展宽。（3）如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象，放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非常严重，导致分离失败。,制备HPLC技术问题流速问题,一根大柱子（c-18，高压柱)，可使用流速在150ml/min左右，但系统只能提供20ml/min的流速，如果使用这套系统进行纯化，效果会如何呢？这样会不会使样品扩散？使分离效果下降？,对分离不会有什么问题的，一般来讲，制备柱的填料大于分析型色谱填料，内扩散阻力也相应地大很多。流速越低越有利于分离度的改善，样品浓度也会相应提高。唯一的坏
16、处是：分离时间会很长,？,制备HPLC技术问题流速问题,制备HPLC技术问题组分保留时间的估计,用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。,制备HPLC技术问题梯度,gradient elution can be applied on prep system.two prep system:1.Luna 20 x50mm RP C18 5um column,MS as detector,gradient:5%ACN+95%H2O to 95%ACN+5%H2O in 9mins,flow
17、rate 40ml/min2.Luna 20 x150mm PR C18 5um column,UV detector,gradiatet:same as above,but total rum time 18mins,flow rate 20ml/minboth systems can give good separation.,制备HPLC技术问题梯度,分离效果取决于梯度的选择，理论上梯度越小，分辨率越高。在分析上摸好条件，上制备柱往往还要降低一些洗脱液的浓度。,制备HPLC技术问题流动相,流动相中磷酸盐的去除：,样品浓缩后全部进样吸附，用水冲去盐后，再用甲醇或其他适当溶剂将目标物冲下，即
18、可只要样品在水洗脱时有一定的保留（反相填料柱），可以一直加样至最大负荷（检测到样品流出）,用G25脱盐,可以采用离子吸附的办法去掉（可以参考离子吸附有关技术）。,制备HPLC技术问题柱子再生,柱子再生处理办法如下：（1）依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。（2）如果效果不明显，将柱子按以上顺序反冲，一般将大大降低柱子效果，不到不要没有办法才采用。（3）如果效果还是不好，就需要打开色谱柱，超声波清洗筛片（这样也会使柱子效果下降）。必要时挖掉色谱柱内受污染部位，填入新的填料，还可用3个月。（填的时候小心，别重新污染柱子）,制备HPLC技术问题组分的收集,收集组
19、分时，通常有以下情况：（1）可获得良好分离，主峰：使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分：超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,制备HPLC技术问题组分的收集,边缘切割与中心切割技术,边缘切割,制备HPLC技术问题组分的收集,边缘切割与中心切割技术,中心切割,制备HPLC技术问题组分的收集,边缘切割与中心切割技术,中心切割,制备HPLC新技术循环色谱,采用循环功能，对各种难分离样品进行分析或制备，即使样品可以根据用户设定的次数反复经过色谱柱进行分离，最终的分离结果是每次分离效果的累加，这样，在一般的液相色谱上很难或不能分离的样品都可以使用循环功能分离开。,制备HPLC新技术柱切换技术,包括改变流动相的所有技术。可使一根色谱柱的洗脱液流入另一色谱柱。具有如下优点：分辨能力和选择性得到提高样品可在运转中纯化微量的样品可得到富集可以减少用于清洗色谱柱等所花的时间,制备HPLC新技术柱切换技术,Thank you!,
