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1、动物基因工程（Animal Genetic Engineering）,第十章,主要内容,第一节 目的基因的获取第二节 基因体外重组第三节 转基因第四节 基因敲除与基因诊断第五节 动物克隆技术,动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术；或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。,什么是动物基因工程？,基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种
2、DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引人某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。,基因工程的基本操作,第一节目的基因获取,1 基因组DNA及总RNA的提取 动物DNA的来源（核DNA、线粒体DNA、质粒DNA）1.血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、化石及 耳朵等活体组织；2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA来源：新鲜组织或细胞,DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒方法-；RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理,Genome DNA,Total RNA,2 基因文库基因文库(Gene
3、 library)包括cDNA文库(cDNA library)和基因组文库(Genome library)。文库:cDNA是指以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。RT-PCR：反转录PCR（Reverse Transcription PCR）,cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。实际为不包含内含子的基因组文库。,cDNA文库(cDN
4、A library),基因组文库（Genomic DNA Library）从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。,文库构建,3 PCR,*PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应（Polymerase Chai
5、n Reaction）,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。*由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。,PCR的原理：体外DNA复制。包括高温变性、低温退火和中温延伸过程。,PCR反应五要素 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+Taq DNA聚合酶1）来自水生栖热菌 Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能PCR反应条件优化：引物设计：,PCR的类型,巢式PCR 原位PCR多重PCR 定量PCR不对称PCR 差异显示PCR共享引物PCR 重组PCR锚定PCR(十一)RT-PCR彩色PCR(十
6、二)RAPD-,多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA 锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。,基本概念,巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。差别显示：是根据绝大多数真核细胞mRNA3端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同
7、的mRNA反转录成cDNA。,基本概念,4 基因克隆 基因克隆（genecloning）：或分子克隆,又称为重组技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。克隆（clone）：指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。基因克隆步骤：1)获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目的基因与载体在体外连接；)重组DNA分子导入宿主细胞；)筛选、鉴定阳性重组子；)重组子的扩增与或表达。,5 核酸分子鉴定 1、PCR结合测序：2、核
8、酸杂交技术（基于碱基互补配对）,Southern杂交Northern杂交原位杂交,序列测定,Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法。,*是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（Southern Blot）。*通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基因的存在及大小。,Southern杂交,Northern杂交,*也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。*因与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，故被趣称为Northern杂交。,
9、原位杂交,*细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。*细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。,Western(印迹)杂交,*蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。*与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂交相对应，称为Western杂交。*常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。,第二节 基因体外重组技术,1 重组质粒构建,载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。质粒是指一种存在于细胞内能独立复制的染色体外的 DNA。,1)质粒图谱登记号：00522)质粒名
10、称：pBudCE4.13)来源：Invitrogen4)用途：真核表达载体5)详细资料6)是否可以共享7)联系方式：PM,重组质粒的构建过程,2 重组基因的鉴定,抗性筛选法：能否生长；蓝色和白色菌落，其中白色菌落可能含重组质粒。PCR：双酶切：,3 体外表达,*在原核生物中的表达：细菌、酵母,*在真核生物细胞中的表达：人工培养肝细胞、上皮细胞,人工培养的人成骨细胞,人成骨细胞内的pEGFP蛋白表达,第三节 转基因技术（Transgenic technology）,1 转基因与转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因
11、导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。,概念转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变。转基因动物：所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,转基因的方法1、显微注射法：将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过D
12、NA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。2、体细胞核移植方法：先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选。然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。,3逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。4胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。,转基因的方法,转基因动物的应用前景1、研究基因的
13、结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。4、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。,四个主要国家转基因作物种植面积占全球。美国占，达万公顷，转基因作物产量也居世界第一，美国种植的的大豆、的棉花和的玉米都是转基因作物。阿根廷占，达万公顷。加拿大占，达万公顷。中国第四位，占，达万公顷。欧盟国家总面积不到万公顷，.左右。,四个转基因作物种植大国2002年数据,存在问题1、食品安全问题：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人体内表达？2、技术问题：1）成本；2）
14、成功率；3）基因组的有效整合、稳定遗传；,什么是生物反应器？生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。,用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。据预测，2010年世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到500亿美元以上。,生物反应器的种类及应用,第四节 基因敲除与基因治疗(Gene Knockout&Gene Therapy),什么是基因敲除技术？基因敲除（gen
15、e knock out）是80年代初出现的一项新的基因工程技术。采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲除动物。,示例,基因敲除技术的应用1、研究基因调控和基因功能；2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学；4、治疗遗传病，即基因治疗。5、改造生物、培育新的生物品种。,基因治疗与基因疫苗,基因治疗(gene therapy)是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用（也包括剔除或抑制某些导致疾病的基
16、因），从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入载体，然后导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。,传统的基因治疗指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞的基因组发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，暂时表达产物发挥治疗作用的基因治疗方法叫做基因疗法(gene therapeutics)。广义的基因治疗还应包括基因调控，如利用RNAi技术抑制基因表达。,基因治疗的途径,第五节 动物克隆技术(Animal Cloning Technology),C
17、reating Dolly！,1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。,1998年4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育。2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊”。,多莉的生命历程,罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内。科学家共培育277个胚胎，只有多莉成功出生。1996年7月5日，多莉降临人世。直到1997年2月23日才公布于众。,什么叫克隆？细胞核移植得到的个体都叫做克隆。核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移人去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。根据核供体的来源不同，可将其分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物技术。通常所说的动物克隆指体细胞克隆，即动物的无性繁殖。,动物克隆的意义,1、体细胞与胚胎干细胞的相互转化,胚胎干细胞,体细胞,动物克隆的意义,2、对传统动物繁殖模式的挑战；（AI、Clone）3、对社会伦理的挑战；,4、保存物种、延续生命、提高人口素质？,
