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1、动物实验基本技能,医学科研实验中心2013.7.3,大鼠生物学特性,大鼠汗腺极不发达，仅在爪垫上有汗腺，尾巴是散热器官。大鼠无呕吐反应，对许多药物易产生耐药性。对营养缺乏敏感，可发生典型的缺乏症状。大鼠无胆囊，胆汁通过总胆管进入十二指肠。大鼠神经系统与人类相似。,动物实验基本技能,编号与标记方法大鼠的抓取大鼠麻醉供试品给予方法采集体液大鼠的采血,一、编号与标记方法,染色法穿耳孔法标牌法烙印法剪毛法,在每组动物不超过l0只或一个实验不超过40只的情况下适用实验动物：大鼠、小鼠染色剂：3-5苦味酸溶液，可染成黄色,染色法：单色涂染法,涂染原则：从左到右、从上到下左前肢为1号、左侧腹部2号、左后肢3
2、号，两耳后部4号、背部5号、后肢背部6号，右前肢7号、右侧腹部 8号、右后肢9号头部为40号、尾巴根为10号。,方法步骤,在每组动物不超过100只的情况下适用实验动物：大鼠、小鼠常用染色剂：3-5苦味酸溶液，可染成黄色，作为“个”位数常用染色剂：0.5%中性红或品红溶液，可染成红色，作为“十”位数,染色法：双色涂染法,用两种颜色同时进行染色标记 用苦味酸(黄色)染色标记作为个位数，个位数的染色标记方法同单色涂染法用品红(红色)染色标记作为十位数,方法步骤,左前肢为10号、左侧腹部20号、左后肢30号两耳后部40号、背部50号、后肢背部60号右前肢70号、右侧腹部 80号、右后肢90号第100号
3、不作染色标记,方法步骤,穿耳孔法：用专用耳空器在动物耳朵不同部位打一小孔或缺口表示一定号码的方法。原则是：左耳代表十位，右耳代表个位。实验动物：兔、犬、猪标牌法：一般挂在动物的颈部、耳朵、脚上。实验动物：犬、猴烙印法剪毛法,其它方法,器材：大鼠饲养盒+面罩 1套方法步骤：首先戴好防护手套用右手拇指和食指抓住小鼠尾巴中部将大鼠提起，放在大鼠饲养盒的面罩上左手顺势按、卡在大鼠躯干背部，稍加压力向头颈部滑行以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈皮肤，其余三指和手掌握住大鼠背部皮肤，完成抓取固定,二、大鼠的抓取,动物全身麻醉分四期：第一期：随意兴奋期，出现运动与运动失调 第二期：不随意兴奋期，由意识完
4、全丧失至规则的自动呼吸开始时止 第三期：外科麻醉期 第四期：延髓麻醉期，进入此期，麻醉已严重过量,三、实验动物麻醉,麻醉方法：全身麻醉和局部麻醉，通过吸入、注射（静脉、皮下、肌肉、腹腔）、口服、灌胃等方法使动物麻醉常用麻醉药物：乙醚（吸入），戊巴比妥钠、硫贲妥钠、氯胺酮（静脉），普鲁卡因、利多卡因（局麻）,麻醉方法与麻醉药,常用麻醉药剂量与注射途径,麻醉前应禁食8h以上麻醉前应准确称体重注意麻醉剂量麻醉过程中注意观察动物的反应情况注意保温静脉注射时必须缓慢，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平,注意事项,原理：是使用非挥发性麻醉药对动物进行全麻术的方法器材：3戊巴比妥钠、注射器,大鼠
5、的麻醉,用左手将大鼠捉持保定，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺针头刺入皮下后进针3mm左右，接着使注射针头与皮肤呈45度角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液,大鼠麻醉步骤,经口给药注射给药 1.皮下注射给药 2.皮内注射给药 3.肌肉注射给药 4.静脉注射给药 5.腹腔注射给药,四、供试品给予方法,自动口服给药灌胃给药:是借器械将药物直接灌入动物胃内的方法，此法可以准确控制给药量，但如果操作不当易造成动物死亡,经口给药,将灌胃针连接在注射器上，吸入一
6、定量的药液操作前，大致量一下从口到胃的距离，估计灌胃针头插入的深度左手捉持动物，使头部向上；右手持针，把灌胃针头的前端放进动物的口腔，顺着上腭部插入咽部，顺咽后壁轻轻往下推，灌胃针会顺着食管滑入动物的胃内，此时没有抵触感用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的药液灌入动物的胃中,灌胃给药,剂量：小鼠约0.1-0.5ml10g体重，最大体积为1.0ml/只；大鼠约1-2 ml100g体重，最大体积为1.0ml/只注意：在灌胃过程中，避免误插入气管,灌胃给药,1.皮下注射给药原理：将药液注入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环器材：1m1注射器1支、生理盐水、烧杯、酒精、碘酒、棉球,注
7、射给药,注射部位：颈背部、腋下、腹侧和后肢的皮下常规消毒注射部位的皮肤，用注射针头取一锐角角度刺入皮下.将针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。注射量：0.01ml0.03mlg体重,皮下注射方法步骤,此法用于观察皮肤血管通透性变化或皮肤反应注射部位：动物背部，脱毛，用针头平直进入皮内注射药液后，皮肤表面鼓起小泡，停片刻拔出针头,2.皮内注射给药,原理：将药液注入动物的肌肉组织，经毛细血管吸收进入血液循环 器材：1ml注射器1支、生理盐水、烧杯、酒精、碘酒、棉球注射部位：一般选择肌肉丰富而无大血管通过的臀部或大腿外测，回抽无血即可注射,3.肌
8、肉注射给药,原理：将药液注入小鼠的尾静脉器材：1m1注射器1支、生理盐水、烧杯、金属笼或大小鼠器、酒精、碘酒、棉球,4.静脉注射给药,将大小鼠放在金属笼或小鼠固定器中，通过金属笼或大小鼠固定器的孔拉出鼠尾巴用左手捏住鼠尾巴中下部，用75酒精棉球反复擦拭尾部；注射时，以左手拇指和中指捏住鼠尾两侧，用食指从下面托起尾巴，以无名指夹住尾巴的末梢。右手持4号针头的注射器，使针头与静脉平行(小于30度角)；从鼠尾巴下1/4处进针，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，即可注入药物 拔出针头后，用干棉球压住注射部位约l-2min，防止出血注射量：小鼠 0.005m10.01 m1g体重。大
9、鼠1.0-2.0 m1100g体重,静脉注射方法步骤,原理：将药液注入大鼠的腹腔器材：注射器1支、生理盐水、烧杯,5.腹腔注射给药,用左手将大鼠捉持保定，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部；右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺针头刺入皮下后进针3mm左右，接着使注射针头与皮肤呈45度角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液注射量：0.010.02m1g体重,腹腔注射方法步骤,胸水腹水消化液尿液骨髓液动物精液乳汁,五、采集体液,代谢笼法:此法较常用于大、小鼠，成熟小鼠尿量1-3ml/24h，大
10、鼠为55-75ml/24h导尿法：常用于雄兔、犬等动物，要轻度麻醉，可以采到无污染的尿液压迫膀胱法：此法适用于兔、猫、犬等大动物输尿管插管法膀胱插管法膀胱穿刺法剖腹采尿法反射排尿法,尿液的采集,眼眶后静脉丛(窦)取血器材：毛细管(玻璃或塑料均可)、1肝素溶液、干燥皿、乙醚、试管、干棉球,六、大鼠的采血,先将毛细管浸泡在1肝素溶液中数分钟，取出干燥备用将大鼠进行麻醉，使大鼠保持侧卧位左手拇指、食指抓住两鼠耳之间的颈部头皮，并轻轻向下压迫颈部两侧，致大鼠静脉血回流障碍，眼球外突，眶后静脉丛充血右手持毛细管由大鼠的目内眦部插入结膜，使毛细管与眶壁平行地向喉头方向推进，深度约35mm轻轻旋动毛细管，使
11、其穿破静脉丛，让血流顺毛细管流出采血量：0.40.6ml次,方法步骤,脑立体定位技术,某些颅外标记与颅内结构具有相对固定的位置关系，确定脑内功能核团的位置核团微量注射电位引导核团的刺激或损毁,脑立体定位仪,脑立体定位仪的调试:摆稳定位仪，用水平仪测水平。检验电极移动架上各个轴向滑尺是否保持互相垂直，微量注射器针尖是否光滑垂直。检查定位仪各衔接部位的螺丝有无松动。检查头部固定装置两侧是否对称。检查耳杆使两耳杆尖端相对,以此判定耳杆固定的准确程度。,鼠颅的固定:将麻醉大鼠置于脑立体定位仪上，鼠颅依靠两耳杆及切牙钩三点固定。脑立体定位仪坐标“0”点的测得:按照Paxinos大鼠脑立体定位图谱，以颅骨
12、前囟即冠矢点作为前后方向的“0”参照点，当微量注射器的针尖对准冠矢点时,读取立体定位仪三维坐标上标尺的数值，此数值即是“0”点坐标。,生物信号在体检测遥控系统,Illustration of the high fidelity recording provided by the C10 telemeter,which allows for the accurate measurement of pulse pressures in mice despite their high heart rate(10 per second!).,Bursts of renal sympathetic ne
13、rve activity made in a conscious,freely behaving rat 64 days following telemeter implantation,PowerLab 系统,膜片钳系统,活体生物发光和荧光成像技术,59,理想的光源：萤火虫荧光素酶（luciferase）,基因、细胞、活体都可被荧光素酶基因标记。,活体生物发光成像系统原理,遗传学标记实时、原位多波长检测,标记癌细胞,标记细菌,标记转基因鼠,60,荧光素酶的表达,将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。,启动子,染色体,体内表达,外源注入底物,活跃细胞,
14、体内发光,61,活体成像技术的主要应用,标记细胞 癌症及药物研究,标记病毒,DNA,RNA 病毒学及基因治疗,转基因动物模型,蛋白质相互作用、代谢、发育、内分泌学，等等,标记基因,siRNA研究的应用,干细胞,免疫,其它,细胞凋亡,组织特异性基因表达,标记细菌,62,体内药物分析的生物发光检测,1x106，PC-3M-Luc肿瘤细胞，皮下注射,14天,21天,28天,35天,雄性SCID小鼠,处理方式 细胞数,无治疗对照 2.2x109,5-FU治疗 2.8x108,丝裂酶素 3.6x106治疗,小鼠#6 n=7,小鼠#40 n=8(从第11天开始给药),小鼠#31 n=8(从第11天开始给药
15、),63,乳腺癌原位接种,PNAS 2010,10,64,U87 脑胶质瘤成像 cancer research 2011,8,PTA of U87 humangliomas in mouse brains.A,representative bioluminescenceimages of nude mice bearingU87-TGL tumors with differenttreatments(see Materials andMethods).,65,肿瘤转移,66,基因治疗载体的构建,AdTSTA-FL的表达活性比AdCMV-FL高100倍以上,AdTSTA-FL（107）,AdCMV-FL（107）,Days 5 7 10 13,103,105,谢 谢,
