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1、1,第九章 吸光光度法 9.1 吸光光度法的基本原理 9.2 光度计及其基本部件 9.3 显色反应及显色条件的选择 9.4 吸光度测量条件的选择 9.5 吸光光度法的应用,2,9.1 吸光光度法的基本原理 一、概述：比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种 方法。,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,3,经证明：不论溶液有无颜色，当一定波长的光通过该溶液时，总有一定程度的吸光作用。并且随单位体积内溶液中该物质的质点数目增多，对光的吸收越强。分光光度法：测量物质对一定波长光线的吸收程度确定组分含量的方法。,4,特点：,灵敏度高：测定下限可达10510
2、6molL-1,10-4%10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差25 操作简便快速应用广泛,5,化学分析与仪器分析方法比较,化学分析：常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器,准确度高,仪器分析：微量组分(1%),Er 1%5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器,灵敏度高,例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)0.1mg,重量法 m(Fe2O3)0.14mg,称不准,容量法 V(K2Cr2O7)0.02mL,测不准,光度法 结果0.048%0.052%,满足要求,6,二、光的基本性质 电磁波的波粒二象性,波动性,光的传播速度:,c真空
3、中光速 2.99792458108m/s3.0 108m/s波长，单位：m,cm,mm,m,nm,1m=10-6m,1nm=10-9m,1=10-10m频率，单位：赫兹（周）Hz 次/秒 n折射率，真空中为1,7,与物质作用,电场向量,磁场向量,传播方向,Y,Z,8,微粒性,光量子，具有能量。,h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js频率E光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特),9,波粒二象性,结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合 在一起。,10,光
4、学光谱区,10nm200nm,200nm 400nm,400nm 780nm,780 nm 2.5 m,2.5 m 50 m,50 m 300 m,11,三.溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱,不同颜色的可见光波长及其互补光 p238溶质分子对光的吸收：具有选择性,12,吸收曲线：P239 将不同波长的单色光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测得每一波长下溶液对光的吸收程度（即吸光度A），然后将A对波长作图，即可得吸收曲线（吸收光谱，absorption spectrum）。该图显示了物质对不同波长光的吸收能力。最高吸收峰对应下的波长称之为最大吸收波长，用max表示。定性分析：据物质不同吸收曲
5、线的形状和最大吸收峰各不相同。定量分析：同一物质，最大吸收峰位置不变，其吸光度随浓度增大而增大。,13,Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱,300,350,400,500,525 545,MnO4-,600,700,/nm,350,Cr2O72-,14,苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱,15,16,四、光吸收基本定律:、Lambert-Beer定律,朗伯定律(1760年)A=lg(I0/It)=k1b,比尔定律(1852年)A=lg(I0/It)=k2c,A=lg(I0/It)=kbc,17,、T透光率（透射比）（Transmittance）,A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT=ab
6、c(9-1),18,吸光度A、透射比T与浓度c的关系,19,、a 吸光系数 Absorptivity,当c的单位用gL-1表示时，用a表示，A abc（9-1）a的单位:Lg-1cm-1,当c的单位用molL-1表示时，用表示。摩尔吸光系数 Molar Absorptivity A bc（9-2）的单位:Lmol-1cm-1,当c的单位用g100mL-1 表示时，用 表示，A bc，叫做比消光系数,20,:数值上等于浓度为1molL-1吸光物质在1光程中的吸光度。P240 是物质吸光能力的量度。仅与波长、物质的性质、溶剂有关。物质不同，吸光系数不同 定性分析 同一物质，随波长、显色剂的变化而变
7、化定量分析,21,，方法的灵敏度。由实验结果计算时，因以总浓度代替吸光物质的实际浓度，得出的是表观摩尔吸收系数。=a（9-3）Lambert-Beer定律不仅适用溶液，也适用其他均匀非散射的吸光物质（气体、固体）。是各类吸光光度法定量分析的依据。,22,.吸光度的加和性,A=A1+A2+An(9-4),用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂等对光的吸收等。,23,吸光度与光程的关系 A=bc,24,吸光度与浓度的关系 A=bc,25,朗伯-比尔定律的分析应用,溶液浓度的测定,A bc,工作曲线(标准曲线),26,五、偏离朗伯比耳（尔
8、）的原因、非单色光引起的偏离朗伯比耳定律只适用单色光 p241仪器仅能提供波长范围较窄的复合光,27,物质对不同波长光的吸收能力不同，而导致偏离。P241 减免：在max处测量 较好的仪器，单色能力好 2、化学因素引起的偏离,28,2、化学因素引起的偏离 吸光物质的性质和数目决定溶液对光的吸收。还假设吸光粒子之间无相互作用。稀溶液能很好的满足要求。高浓度溶液中粒子之间距离较近，每个粒子都可能影响邻近粒子的电荷分布，而使它们的吸光能力发生改变。溶液中的吸光粒子常因离解、缔合、配 合形成新的化合物或互变异构体，而改变粒的性质、浓度，对光的吸收产生偏离。C，偏离。减免：配稀溶液,29,减免：配稀溶液
9、，避免溶液产生胶体与混浊1单色光(见p241证明)应选用max处或肩峰处测定 2.吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)3.稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强,30,亚甲蓝阳离子单体 max=660 nm二聚体 max=610 nm,二聚体的生成破坏了A与c的线性关系,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱a.6.3610-6 molL-1b.1.2710-4 molL-1c.5.9710-4 molL-1,31,9.2 光度计及其基本部件 P242 9.2.1 分光光度计的类型,32,光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管)photodiode array
10、s(PDAs)同时测量200820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快316倍,信噪比增加 316 1/2 倍.,多通道仪器（Multichannel Instruments）,其他类型分光光度计,将光度计放入样品中,原位测量.对环境和过程监测非常重要.,纤维光度计,33,镀铝反射镜,纤维光度计示意图,34,纤维光度计,35,9.2.2 光度分析的几种方法,1.目视比色法,方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。,36,2.光电比色法,通过滤光片得一窄范围的光(几十nm),37,3.吸光光度法和分光光度计,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.,38,滤光片：有色玻
11、璃片，只允许和它颜色相同的光通过，得近似的单色光。其质量以“半宽度”表示。半宽度：峰高一半处的峰宽。最大透光度的一半处曲线的宽度。选择原则：滤光片的颜色与溶液的颜色互补。滤光片透过的光应是颜色溶液最易吸收的光。,39,722型分光光度计结构方框图,光源,分光系统,吸收池,检测系统,40,分光光度计的主要部件,光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。棱镜:玻璃3503200nm,石英1854000nm 半宽度 510nm 光栅:波长范围宽,色散均
12、匀,分辨性能好,使用方便。半宽度 0.1nm,41,单色器,棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,42,光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。,原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.,43,吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池1、光洁，2、液2/3处3、手持毛玻璃处 4、透光面垂直于光束方向检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管指示器：低档仪器：刻度显示（p)中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,44,检测器,硒光电池,Ag、Au,45,光电管,红敏管 6
13、25-1000 nm蓝敏管 200-625 nm,46,光电倍增管,160-700 nm,1个光电子可产生106107个电子,47,9.3 显色反应与分析条件的选择,9.3.1 显色剂与显色反应,无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+H2O2 TiOH2O22+,有机显色剂:,48,有机显色剂,OO型：,磺基水杨酸,NN型：,邻二氮菲,丁二酮肟,ON型：,PAR,S型：,双硫腙,49,显色反应的选择,*灵敏度高，一般104*选择性好 显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好,max60 nm.*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,50,1.显色剂用量（c(M)、p
14、H一定）,9.3.2 显色条件的确定,c(R),c(R),c(R),Fe(SCN)n3-n,Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5 橙红Mo(SCN)6-浅红,51,2.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH,pH1pHpH2,52,邻二氮菲亚铁反应完全度与pH的关系,Fe2+3R,31021.3,c(R)R=10-4molL-1,53,pH38为适宜的酸度范围,54,3.显色温度及显色时间,T1(),T2(),A,t(min),另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等,55,9.3.3 干扰及消除,1.化学法,测Co2(含Fe3+):(掩蔽法),56,测Co2:(生成配合物性质不同
15、),测Fe3:(控制pH),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。,57,2.物理法,选择适当的测定波长,58,吸光光度法仪器主要差异比较,59,9.4 吸光度测量条件的选择 9.4.1 入射光的选择 1、首先选择在max下进行测量，灵敏度高。对朗伯-比耳定律的偏离小。若最大吸收波长不在仪器可测波长范围内 或处于干扰成分有强烈的吸收时 2、选择次高峰对应波长为入射波长 应选择值随波长改变不太大的区域内的波长。,60,9.4.2 参比溶液的选择 因吸光的加和性，除有溶质的吸光外，还包括显色剂、溶剂，其他试剂对光的吸收 应将显色剂、溶剂，其他试剂对光的吸收的吸收扣除-选择参比溶液
16、 参比溶液的选择原则：,61,选择适当的参比溶液,1.仅配合物有吸收，溶剂作参比。如 phenFe2+标准曲线2.显色剂或其他试剂略有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的 Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。,62,3.试样液中其它成分有吸收，但不与显色剂反应：显色剂无吸收时：试样溶液作参比。如 测汽水中的 Fe 显色剂略有吸收时：于试液中加入掩蔽剂将被测成分掩蔽，再加入显色剂，将该溶液作参比。,63,9.4.3 吸光度读数范围的选择,光度计的读数误差一般为0.22(T),由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的T引起的误差不同。,64,吸光光度法中，仪器测
17、量不准也是误差的主要来源。A=-lgT=bc,透过率读数误差DT基本是个常数，因为T的标尺是均匀的，DT是由仪器刻度读数不可靠引起的误差，和T的大小无关,吸光度读数误差DA是随着A的不同而变化，因为A的刻度标尺是不均匀的，DA随着A的增大而增大,65,不同的吸光度数值A下，吸光度读数误差带来的测定浓度误差dc/c是不同的,66,假设T为0.5%，绘制不同透过率下浓度相对误差变化曲线如图9-16（p254）：T过高或过低，dc/c都是很大的，T在适宜的范围内测量误差才是可以接受的 利用（9-5）公式令其导数为零，求出：T=0.368（A=0.434）浓度误差最小，约为1.4%。,67,浓度测量的
18、相对误差与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在70 10,A在0.151.0之间(调c,b,),68,调整比色皿厚度和取样量等达到,浓度误差大小和T/A的读数范围有关：T=7010%/A=0.151.0时，浓度测量误差为1.4-2.2%；如果要求准确度高些，可控制,69,吸光光度法的应用,1.单一组分测定（标准曲线法）,1)金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂,2)磷的测定:DNA中含P9.2%,RNA中含P9.5%,可得核酸量.,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小),磷钼(V)蓝(
19、大),70,2.多组分的测定,a)在1处测组分x,在2处测组分y,b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y,c)x,y组分不能直接测定 P254A1=xl1 bcx+yl1 bcy(在1处测得A1)A2=xl2 bcx+yl2 bcy(在2处测得A2),xl1,yl1,xl2,yl2由x,y纯液 在1,2处分别测得,71,3)蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5)水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7)紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。,72,4.配合物组成的测定,3.一元弱酸离解常数的测定,5.双波长分光光度法消除干扰,6.导数分光光度法,
