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1、第二章 均相酶反应动力学,均相酶反应研究历史酶催化反应特性简单的酶反应动力学酶反应抑制动力学温度与pH值对酶反应动力学的影响酶的失活动力学,2.1 研究历史,1902年，V.Henry开始，研究了转化酶、苦杏仁酶和淀粉酶的催化机理，并给出了动力学方程，但结果有错误。1913年，L.Michalis和M.Menten用快速平衡法推导并发表了米氏方程。1925年，G.L.Briggs和J.B.S.Haldane提出了定常态法动力学解析方法。Altonan(1965)和W.W.Cleland(1963)又推导了两种以上底物参与的酶反应。1965年J.Monod对变构酶进行了研究 均相酶反应动力学反映
2、的是酶催化反应的本征动力学关系，是从研究酶反应的机理开始的，常着眼于酶的初始反应速率。,酶反应动力学研究思路,影响均相酶反应速率的因素有浓度因素（酶、底物、产物和效应物）、外部因素（温度、压力、溶剂的介电常数、pH值、离子强度等）和内部因素（底物及效应物结构、酶的结构），其中最重要的是浓度因素，而以浓度为自变量参数求得的速率常数，又会受到内外各种因素的影响，这一基本思想构成了均相酶反应动力学的基本骨架。,2.2 酶催化反应特性,酶是活细胞为其自身代谢活动而产生的具有催化活性的蛋白质。具有高效的催化活性，在可比条件下酶催化的反应速率要比无机催化剂高1071013倍高度的专一性，即酶对底物及其催化
3、的反应有严格的选择性，包括反应专一性和底物专一性两个方面酶的催化活性可被调控，比如酶浓度的调节、激素调节、共价修饰调节、抑制剂调节和反馈调节等酶易变性和失活，它对环境的变化非常敏感，如高温、强酸、强碱、重金属等都将引起酶的失活，且这种失活多为不可逆，因而酶促反应多在温和的条件下进行。,酶的催化反应机制,锁钥学说：酶和底物必定存在着互补的结构特征，只有符合这种互补结合的物质才是底物，才能被酶所催化。诱导契合学说：底物的存在使酶的的活性部位构象变化，酶与底物完全结合，并使催化基团转入有效的作用位置。,2.3 简单的酶反应动力学,酶催化反应的机理三点基本假设平衡假说拟稳态假说米氏方程方程特性参数求取
4、,2.3.1 酶反应机理,活性络合物学说S+E ES E+P根据质量作用定律：,k+1,k-1,k+2,2.3.2 三点假设,反应过程中，酶的总量保持不变，即e0=e+es。这表明在酶反应过程中酶是稳定的。与底物浓度相比，酶的浓度很小，即se，因而可以忽略由于生成中间复合物所消耗的底物。产物浓度很低，产物的抑制作用可以忽略，并且不考虑逆反应，即该反应速率为初始反应速率。,2.3.3 平衡假说,平衡假说：认为生成产物的一步的速率是整个酶催化反应 控制步骤，而生成复合物的可逆反应达到了平衡状态。即k+2k-1 根据上述假设，有下式成立：由,2.3.4 拟稳态假说,因为底物浓度远大于酶浓度，因此当络
5、合物解离成产物释放出来的游离酶又立即与底物结合与活性络合物，因此活性络合物的浓度不随时间的变化而变化，即 据反应机理和上述假设，有下述方程成立：,平衡假设与拟稳态假说,当k+2K-1时，Km=Ks,即生成产物的速率大大慢于酶底物络合物解离的速率，这对于许多酶反应也是正确的，因为生成的复保物其结合力是弱的，因而其解离速率很快，而复合物生成产物则包括化学键的断开与生成，其速率要慢得多，因而拟稳态法更为合理。即其中 rmax与Km称为模型参数，其物理意义分别为：,其中：1、，即最大反应速率，表示体系中所有酶均为活性络合物时的反应速率，而k+2则表示了单位时间内一个酶分子所能催化底物生成产物的分子数，
6、它表示了酶催化能力的大小。由于精确知道所使用的酶的纯度和分子量是困难的，因此将它们合为一个参数2、Km是酶的特征常数，它表明了酶与底物结合力的大小，Km值大，表明，酶与底物的结合力弱，反之，酶与底物的结合力强，其单位与浓度相同。Km值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条件有关，其量纲为浓度单位，其值与反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度相等，即，其数量级一般为106102 mol/L,2.3.5 方程特性,米氏方程中反应速率与底物浓度的关系满足双曲函数的形式即：当sKm时，rs=rmax当s浓度介于上述两种情况之间时，为双曲函数,2.3.6 参数的求取（微分法）,L-B作图法H-W法E-H
7、因 所以又称为微分法,2.3.6 参数的求取（积分法）,重排为,例题,对于某均相酶反应，已知，时，若反应进行1 min，则有2%底物转化为产物，试求：当反应进行到3min时，底物转化率为多少，产物浓度为多大？当底物浓度下降10倍时，反应也进行3min，此时的底物转化率为多少？为多少？,例题,因为s0Km(0.005Km)，可视为一级反应动力学，对于一级反应动力学，当t=1 min，Xs=2%，代入得K0.0202min-1，当t=3min，代入得Xs=6%，则。2）当，此时底物的转化率与底物的初始浓度无关，只与时间有关，因此当反应时间为3分钟时，转化率为6%。3）,2.4 酶反应抑制动力学,抑
8、制是指抑制剂与酶的活性部位结合后，引起酶活力下降的一种效应。任何能直接作用于酶并能降低酶催化反应速率的物质均称为酶的抑制剂。抑制剂抑制底物抑制产物抑制,2.4.1 抑制剂抑制,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制抑制百分数,2.4.1.1 竞争性抑制,机理：酶反应体系中存在有底物的结构类似物，该抑制剂与可以与酶的活性中心相结合，生成非活性络合物，从而导致活性络合物浓度下降而使酶促反应速率下降。S+E ES E+P I+E EI,k+1,k_1,k+2,k+3,k-3,竞争性抑剂存在时反应速率方程,对ES和EI同时应用拟稳态假设，同时根据酶的物料平衡，得出有竞争性抑制剂存在时反应动力学方程为：其中
9、，而 这表明，当有竞争性抑制剂存在时，表观米氏常数增加，即酶与底物的结合力下降。,参 数rmax、Km和KI的求取,多步图法：当体系中i浓度不变时，根据L-B作图法当体系中i浓度发生变化时，,2.4.1.2 非竞争性制,某些抑制剂与酶的非活性部位结合生成复合物，这种结合不影响酶与底物的结合，但形成的E-S-I已使酶的三维空间结构发生变化，故为无活性的端点络合物，从而导致酶促反应速率下降,非竞争性抑制的机理,E+S ES E+PE+I EIES+I ESIEI+S ESI,k+1,k-1,k+2,k+3,k-3,k+4,k-4,k+5,k-5,同样，对ES、EI、ESI分别应用拟稳态假设和酶的物
10、料平衡，得到有非竞争性抑制剂存在时的反应速率方程：其中，,2.4.1.3 反竞争性抑制,抑制剂不能直接与游离酶结合，只能与络合物ES结合生成端点络合物，从而导致酶促反应速率的下降，其机理可表示为：E+S ES E+P ES+I ESI,k+1,k-1,k+2,k-3,k+3,反竞争性抑制的速率方程,对ES、ESI分别应用拟稳态假说和酶的物料平衡得，其中，,2.4.1.4 抑制百分数,抑制百分数是为了衡量抑制剂对酶反应的影响程度，令 因此i的取值范围为0，1，且i越大，表明抑制剂对酶促反应的抑制程度越大,i与抑制类型的关系,竞争性抑制：非竞争性抑制：反竞争性抑制：,例题,在含有相同酶浓度的五个反
11、应物系中，分别加入不同的底物浓度，并测得初始反应速率，再将五个反应物系分别加入0.22 mmol/L的抑制剂，并测定反应速率，结果如下,判断抑制类型，求动力学参数，并写出动力学方程。,例题,首先计算抑制百分数，看抑制百分数和底物浓度之间的关系，确定抑制类型为竞争性抑制。然后利用LB作图法，求得各个参数如下：rmax=100mmoL/Lmin,Km=0.24moL/L,Km=0.44mmoL/L,得KI=0.27mmol/L，所以此方程为,2.4.2 底物抑制,当体系中底物浓度增加到一定程度时，酶促反应速率不增加，反而下降，此时有：E+S ES E+P ES+S ESS,k+1,k-1,k+2,
12、k+3,k-3,2.4.3 产物抑制,产物抑制也是生物界普遍存在的一种抑制方式，当体系中的产物浓度较高时，产物会与酶结合，从而使活性络合物浓度下降。产物抑制同抑制剂一样也有三种抑制方式，将抑制剂的浓度i换成产物浓度p、将KI换成KP，就可得到相应的产物抑制的动力学方程，,2.5 温度与pH对酶反应动力学的影响,pH值与温度能够影响酶反应速率方程的根本原因在于酶是蛋白质。,2.5.1 pH值对酶反应的影响,酶是由不同氨基酸缩合而成的，剩余的氨基酸残基中的两性基团的解离状态与反应体系的pH值有关，而具有催化活性的解离状态只是其中的一种，并且在酶总量中所占的比例会因pH值而异。pH值对酶促反应速率的
13、影响包括两个方面：一是对酶催化活性的影响，二是对酶稳定性的影响，,三状态假设,酶分了存在两个可解离的基团，随着pH值的变化分别呈现出三种状态：EH2 EH EH2 在上述三种解离状态中，只有EH具有催化活性底物的解离状态不变速率控制步骤为由EHS生成产物P的速率其反应机理为：,H+,+H+,H+,+H+,反应机理,S+EH,EHS,EH+P,k+1,K-1,K+2,EH2,Ka,E2-,Kb,EH2S,ES2-,Ka,Kb,反应机理,根据拟稳态假设：得到反应速率方程为：，其中两个参数都与pH有关：,2.5.2 温度对酶反应的影响,温度对酶的酶的反应活性影响复杂。在低温度范围内，反应活性随温度的
14、增加而增加，但温度超过酶所允许的生理温度时，随着温度的升高，酶的活性急剧下降。所有酶均存在有最适作用温度。大多数酶的适宜温度为5-40，只有少数除外。如中温淀粉酶的最适作用温度在85，而高温淀粉酶的最适作用温度在103105，糖化酶的作用温度在65。需要注意的是，最适作用温度受到酶的纯度、底物、抑制剂及酶的催化时间的影响。而温度对酶催化活性的影响是温度两种影响的综合结果，即酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。,温度对酶促反应速率的影响,在适宜的温度条件下，酶促反应速率常数与温度的关系符合阿伦缪斯定理，即 而酶反应的活化能为100120KJ/moL,2.5.2 温度对酶失活的影响,大多数酶的热失活均满足一级失活模型，即 E D 酶的失活速率可表示为：积分得：其中 kd 称为酶的失活速率常数，它与温度的关系亦满足,kd,影响酶失活速率的因素,通过Ea大约为100-120kJ/mol，而Ed大约为200-300 kJ/mol，因而酶失活速率受温度的影响程度比酶反应受温度的影响程度要大的多。除此而外，酶的稳定性还与酶的纯度有关。一般酶在稀溶液中不稳定，在常用的酶制剂中，多含有不纯的物质，有时为增加酶的稳定性，需要添加一些无活性的清蛋白，以保护在稀薄状态下易发生变性失活的酶。,
