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1、第3章 培养基及其配制,讲授：白凤麟,培养基的种类培养基的组成培养基的配制,本章主要内容,培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基,一、培养基的种类,二、培养基的组成,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官
2、建成。,无机营养成分+有机营养成分=基本培养基,Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准,A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史。B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复。C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。,国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,根据植物体内含量多少，可把这些元
3、素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl 7种,按照国际植物生理协会的建议：所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素,1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化
4、剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2、微量元素 在微量元素中，铁的使用最大：一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀,硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长 锰参与植物的光合、呼吸代谢 钼参与氮素的代谢 氯是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出
5、现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,缺锰典型症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,缺硼典型症状：受精不良,籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。,马铃薯,3、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物
6、质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：具有热易变的性质 利于吸收和利用 使用浓度一般在2%5%提供能源和调节渗透压,4、维生素类 以各种辅酶的形式存在 参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6,5、肌醇 环己六醇 细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 促进活性物质发挥作用,6、氨基酸 蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是甘氨酸7、天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂 天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,8、琼脂 是使用最普
7、遍的凝固剂用量一般在610g/L之间颜色以浅、透明度高好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。,9、活性炭 吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化 促进生根缺点：没有选择性10、抗生素 防止外植体内生菌造成的污染,活性炭,11、生长素类 促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素：IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸),生长素作用强弱顺序
8、：,2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根,12、细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离体成花的调控 溶于0.51.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素：KT(激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)ZT(异戊烯氨基嘌呤)玉米素,13、赤霉素类和脱落酸 A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力,14、水作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。注意：用蒸馏水，最好是双蒸水；以保
9、持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,1、MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物,（一）、几种常见培养基的特点,（二）、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,（三）、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,（四）、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 成分较简单，KNO3和（NH4）2
10、SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花粉和花药培养。,AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现浓度：1-10mg/L抗生素：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。作用：可防止外植体内生菌污染。浓度：520mg/L。,1、母液(stock solution)的配制和保存所谓母液是欲配制液的浓缩液。意义:保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。,三、培养基的配制,单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、
11、铁盐、有机物和激素类等,母液的配制方法：,培养基母液的配制,MS母液配制：MSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII铁 盐 200X MSIV有机 物 200X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/ml,将1、2、4、5称好放入烧杯分别溶解混合，将3最后混合，再定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS I X20 HXH,注：Ca2+和S042-混合后易沉淀。,将17称好放入烧杯分别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS II X200 HXH,MS(铁盐),配方用量mg/L,200X（mg）,称量(g),1.FeSO47H2O,27.8,5560,
12、5.56,2.Na2EDTA2H2O,37.3,7460,7.46,将1称好放入烧杯甲溶解，将2放入烧杯乙溶解，再混合定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,1L,MS I X200 HXH,将1、2、3、4称好放入烧杯分别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS IV X200 HXH,将肌醇称好放入烧杯溶解定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS V X200 HXH,母液配制时应注意事项：母液配好后放人冰箱内低温保存（4），用时再按比例稀释。其中III、IV、以及激素类物质应以棕色瓶盛装。母液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用取样时移液管要对应取样，防止交叉污染
13、,2、培养基的配制：MSBA2NAA0.2糖3.0琼脂0.7 pH=5.8 MS：MS I 50 mlMS II 5 mlMS III 5 mlMS IV 5 mlMS V 5 ml BA：20ml;NAA：2ml 糖：30g;琼脂：7g,V贮备液用量V配制/浓缩倍数V激素贮备液 C激素*V配制/0.1mg/ml,培养基的选择,培养基基本培养基 植物激素 培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合。,筛选培养基常用的试验方法：单因子试验 多因子试验 逐步添加和逐步排除试验,1、单因子试验只变动一个因子，通过试验找出该因子的影响及影响程度。如：MS+BA2+NAA（0.
14、1、0.5、1.0mg/L）MS+BA+NAA0.1（1.0、2.0、3.0 mg/L）不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响,2、多因子试验对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。,2种激素5种浓度的实验组合（单位：mg/L）,例如研究NAA和BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的完全试验。,3、逐步添加和逐步排除的试验方法：成功前-逐步添加（各种营养成分）实验成功成功后-逐步排除（减少各种成分）缩小范围在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。,科学安排研究顺序,.定基本培养基，激动素.改良基本培养基.调整蔗糖、琼脂用量.改变pH值.探讨培养的环境条件,
