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1、第三章 培养基的制备,主要内容,第一节、培养基的类型及功能第二节、工业发酵培养基第三节、淀粉水解糖的制备第四节、其他原料,一、培养基的类型和用途二、培养基的选择三、培养基的配制原则四、培养基成分配比的选择,培养基：是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。发酵培养基的作用：满足菌体的生长 促进产物的形成,第一节 培养基的类型及功能,培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养分成多种类型。,按成分不同划分,天然培养基,合成培养基,含用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物,牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基,化学成分完全了解的物质配制而
2、成的培养基,高氏1号培养基、查氏培养基,一、培养基类型和用途,半合成培养基,既含有同天然成分化学成分又含有纯化学成分,按物理状态不同划分,固体培养基,液体培养基,在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%,琼脂含量一般为0.2%-0.7%,不加任何凝固剂,半固体培养基,固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏,观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定,大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究,按使用目的不同划分,基础培养基,鉴别培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基,用来将某种或某类微生物从混
3、杂的微生物群体中分离出来的培养基,用于鉴别不同类型微生物的培养基,选择培养基,在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基,微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化,牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基,加富培养基,特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等,在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长,按用途不同划分,孢子培养基,发酵培养基,是供制备孢子用的培养基,种子培养基,满足菌种生长的培养基,满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养基质,斜面培养基,作用
4、：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。,特点：1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。,种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基)：,培养种子的目的：1.扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,种子培养基特点：1.必
5、须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,（1）根据产物合成的特点来设计培养。（）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,发酵培养基是满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的培养基。它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因
6、素。,发酵培养基,二、发酵培养基选择的依据,根据微生物的特点选择培养基细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四类根据发酵方式选择培养基从生产实践和科学试验的不同要求选择从经济效益方面考虑选择培养基,(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。(6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。(8
7、)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。,三、发酵培养基的配制原则,根据不同微生物的营养需要营养成分的恰当比例渗透压pH值氧化还原电位,注意的几个问题。,培养基中的碳氮的比例（C/N）在发酵工业中尤为重要。如果培养基中氮源过多，会引起微生物生长过于旺盛，而不利于产物的积累；当培养基中的碳源含量不足时，容易引起微生物菌体的衰老和自溶。氮源不足，则微生物菌体生长过于缓慢。培养基中的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也会影响到发酵的代谢途径。不同微生物菌种、不同发酵产物所要求的碳氮比是不同的。即使是同一微生物在不同的发酵阶段，对培养基的碳氮比的要求也是不一样的。,四、培养基成分配
8、比的选择,培养基的组分、配比、缓冲能力、黏度、消毒是否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响。理论+经验数学分析方法正交实验设计，方差分析,正交表因素水平,第一节、培养基的类型及功能第二节、工业发酵培养基第三节、淀粉水解糖的制备第四节、其他原料,一、培养基的类型和用途二、培养基的选择三、培养基的配制原则四、培养基成分配比的选择,一、工业上常用的碳源二、工业上常用的氮源三、无机盐四、生长因子五、前体物质和促进剂,白酒(chinese spirit)发酵：固体发酵培养基；果酒(fruit spirit)发酵：fruit juice or fruit sauce 啤
9、酒(beer)发酵：麦芽汁(wort)液体培养基；酒精(alcohol)发酵：淀粉糖化醪(starch mash)；氨基酸(amino acid)发酵：水解糖液加其他营养成分；柠檬酸(citric acid)发酵：淀粉液化醪乳酸(lactic acid)发酵：淀粉糖化醪；甲烷(methane)发酵：复杂的有机废物发酵；抗生素(antibiotic)发酵：淀粉糖化醪+豆饼粉+麸皮粉；,第二节、工业发酵培养基,碳源：供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础。有糖类、脂肪、某些有机酸等等。氮源：主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。可分为有机氮源和无机
10、氮源。功能：构成菌体成分；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、PH值、氧化还原电位等。无机盐：铅、镁、硫、磷、钾、钠、氯、锌、钴、锰。特殊生长因子：其功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。水：体内各种生化作用必须在水溶液中进行。营养物质必须溶解于水中，才能透过细胞膜被微生物利用。诱导剂、前体和促进剂：胞外酶合成需要诱导物。,一、工业上常用的碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,3、工业上常用的糖类,葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖
11、,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质 量指标,糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应,李江华，无锡轻工大学学报，2004,(半纤维素酶),(1.5g麸皮),二、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮
12、源。,1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,2、有机氮源
13、,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。,例 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,培养基成分用量的多少大部分根据经验而来。但对于主产物代谢途径清楚的物质如酒精，可通过物料平衡计算加以确定。对于次级代谢产物，生物合成途径了解有限，根据化学计算比较困难，但也有人根据物料平衡计算了碳源转化为青霉素的得率。培养基在大规模生产中用量很大，在选用时应尽量地利用较丰富的廉价原料，设
14、法降低成本。例如，赖氨酸（lys）生产中用山芋淀粉，后改为用山芋粉为碳源，这样不仅价廉，而且山芋粉中还含有生物素、镁盐等；省去了原来所加的玉米浆、硫酸镁，并使整个成本降低15%。用于生产疫苗的培养基，通常是用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。,三、无机盐,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定,4、使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑.B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活不加 4.25 120分钟加 K2HPO
15、4 5.45 30分钟加 KH2PO4 4.62 75分钟,、磷酸盐,磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。工业上常用K3PO4.3H20、K3PO4和Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O等磷酸盐，也可用磷酸（使用时应先用NaOH或KOH中和后加入）。玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。,、硫酸镁,镁是某些细菌的叶绿素的组成成分。虽不参加任何细胞结构物质的组成，但它的离子状态是许多重要的酶的激活剂。硫，含硫蛋白质的组分；酶的活性基。硫酸镁,、钾盐,钾不参加细胞结构物质的组成，但它是许多酶的激活剂。,、微量元素,铜、锰、锌、钼、碘、溴等。避免有害离子加入到培养基中。,四、生长
16、因子,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,提供生长因子的农副产品原料：（1）玉米浆：玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物，也是玉米淀粉生产的副产品。一般用量为0.40.8%。（2）麸皮水解液：可以代替玉米浆，但蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。用量一般为1%（干麸皮计）左右。（3）糖蜜,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,五、前体物质和促进剂,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,、前体,在抗生素发酵中
17、大多数的前体物质对生产菌体有毒，故一次加入量不宜过大。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。为避免前体物质浓度过大，一般采取间隙分批添加或连续滴加的方法加入。,所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,、产物促进剂,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,在发酵过程中添加促进剂的用量极微，选择得好，效果较显著，但一般来说，促进剂
18、的专一性强，往往不能相互套用。,能产生抑制作用的物质。,3、抑制剂,在发酵过程中加入某些抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一个代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或使正常代谢的某一中间物积累起来。抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链分枝代谢途径上。e.g.（1）四环素发酵过程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物合成，从而提高四环素的产率。（2）头孢霉素C，添加LMet，可以抑制头孢霉素N的生物合成，从而提高头孢霉素C的产率。,几个发酵培养基例子,第一节、培养基的类型及功能第二节、工业发酵培养基第三节、淀粉水解糖的制备第四节、其他原料,一、工业上常用的碳源二、工业上常用的氮源三、无
19、机盐四、生长因子五、前体物质和促进剂,一、淀粉水解糖的制备方法二、淀粉酸水解原理三、淀粉酸水解工艺四、双酶水解法制糖五、水解糖液的质量要求,许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使葡萄糖等单糖，主要有下列菌种：,酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等大部分的细菌：GA（没食子酸）产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等；其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。,第三节、淀粉水解糖的制备,作为Glu发酵原料的水解糖液，必须具备以下条件：糖液中还原糖的含量要达到发酵用糖的标准。糖液洁净、杏
20、黄色或黄绿色，有一定的透光度。糖液中不含糊精。糖液不能变质。,原料：薯类（甘薯、木薯等）、玉米、小麦、大米（或碎米粉）,例,一、淀粉水解糖的制备方法,酸解法以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的方法。酸酶法先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶水解成葡萄糖。酶酸法将淀粉先用淀粉酶液化，然后用酸水解成葡萄糖。双酶法用淀粉酶和糖化酶将淀粉水解成葡萄糖的工艺。,、酸解法：以酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的方法。,优点：生产方便，设备要求简单，水解时间短、设备生产能力大等。缺点：设备？淀粉转化率？淀粉原料？淀粉乳浓度？,要求有耐腐蚀、耐高压、耐高温的设备。,酸水解过程化学反应复
21、杂，副反应多，淀粉转化率低。,酸水解法对淀粉原料要求较严格，淀粉颗粒不宜过大，大小要均匀。,淀粉乳浓度不宜过高，浓度高，淀粉转化率低。,、双酶法：用淀粉酶和糖化酶将淀粉水解成葡萄糖的工艺。,优点：设备？淀粉转化率？淀粉乳浓度？糖液质量？缺点：酶解反应时间长(48h)，需要的设备多；而且酶本身也是蛋白质，易引起糖液过滤困难。,反应条件温和，不需耐腐蚀、耐高压、耐高温的设备，便于就地取材，容易运作。,酶作用专一性强，淀粉水解的副反应少，因而水解糖液的纯度高，淀粉转化率高。,可在较高淀粉乳浓度下水解，而且可采用粗原料。,该法制得的糖液较纯净，质量高，有利于糖液的充分利用。,、酸酶法：先将淀粉用酸水解
22、成糊精或低聚糖，再用糖化剂水解成葡萄糖。,对于淀粉颗粒坚硬的原料,、酶酸法将淀粉先用淀粉酶液化，然后用酸水解成葡萄糖。,对于颗粒不均匀的原料。,表：酸法与双酶法糖液质量比较,总结优缺点？,二、淀粉酸水解原理,三、淀粉酸水解工艺,、淀粉酸水解的工艺流程,、淀粉乳浓度的选择淀粉乳的浓度越低，水解液的葡萄糖值越高，色泽越淡。,、淀粉酸水解条件控制及对糖液质量的影响,Bx(玻利克斯)：定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。,、酸的种类和用量工业上普遍使用盐酸、硫酸和草酸。一般用盐酸量占干淀粉的0.6%0.7%，pH值调至1.5左右。、糖化的压力和时间压力与水
23、解速率成正比。,中和：降低糖液的酸度，调节pH值，使糖液中胶体物质析出，便于过滤除去。中和剂：纯碱、烧碱。脱色、除杂活性炭吸附法、离子交换法、新型磺化煤脱色压滤一般采用6070C温度压滤。,、水解糖液质量的中和脱色除杂,四、双酶水解法制糖,糊化液化糖化,（一）液化,1、淀粉酶的水解作用。2、淀粉液化的条件及液化程度的控制淀粉的糊化与老化液化的方法与选择,老化：淀粉的老化实际上是分子间氢键已断裂的糊化淀粉重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶过程。,各类液化方法的比较,3、蒸汽喷射液化工艺,工艺流程在配料罐内，淀粉加水调制成淀粉乳，用Na2CO3调pH值处于5.07.0之间。加入0.15%的氯
24、化钙作为淀粉乳的保护剂和激活剂，再加入耐温淀粉酶，搅拌匀后用泵打入喷射液化器。从喷射器中出来的料液和高温蒸汽直接接触，料液在很短时间内升温至9597度。此后料液进入保温罐保温60min，温度维持在9597度，然后进行二次喷射。,3、工艺及条件,蒸汽喷射液化工艺流程：调浆 配料 一次喷射液化 液化保温 95-97 60min 二次喷射 高温维持 二次液化 145 3-5min 95-97 30min 冷却 糖化,碳酸钠调pH、CaCl2、酶,水,蒸汽喷射液化工艺,在第二只喷射器内料液和蒸汽直接接触，使温度迅速升至145度以上，并在维持罐内维持该温度35min左右，彻底杀死耐高温淀粉酶。料液经真空
25、闪急冷却系统进入二次液化罐，将温度降低到9597度。在二次液化罐中加入耐高温淀粉酶，液化约30min，用碘呈色试验合格后，结束液化。特点：短时间内快速升温，完成糊化、液化，使形成的不溶性淀粉颗粒在高温下分散，数量也大为减少，从而使所得的液化液透明又易于过滤，淀粉的出糖率也高。采用真空闪急冷却，增高了液化液的浓度,喷射液化法,1、糖化酶的水解作用2、糖化的工艺条件及控制,（二）、糖化,1、糖化酶的水解作用 糖化是利用糖化酶（也称葡萄糖淀粉酶）将淀粉液化产物糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖的过程。,2、糖化工艺条件及控制,（1）糖化工艺过程液化 糖化 灭酶 过滤 发酵 贮糖计量,调pH4.2-4.5
26、温度60,加糖化酶60保温无水酒精检验,pH4.8-5加热90保温30分钟,降温60-70,温度35左右 接种发酵,（2）糖化工艺条件,酶的用量：80-100U/g淀粉计 糖化条件 温度 pH值 根霉糖化酶 55 5.0*加1,6糖苷键葡萄糖苷酶，抑制糖化酶催化复合反应的作用，DE值99%。,五、水解糖液的质量要求,一般条件下应做到现用现制备，以保证水解糖液的新鲜、纯净。,、淀粉水解糖质量对发酵的影响,淀粉水解不完全时.淀粉水解过度时.淀粉原料中蛋白质含量多时.淀粉原料不同，水解的工艺不同，水解糖液中含生物素量的不同会影响发酵过程中生物量的控制。,葡萄糖的理论收率：实际收率,、淀粉制糖过程考察指标,淀粉转化率：葡萄糖值DE值液化液或糖化液中的还原糖含量(所测得的糖以葡萄糖计)占干物质的百分率。DX值：糖化液中葡萄糖含量占干物质的百分率。,第四节、其他原料,糖蜜原料石油代粮发酵的原料其他发酵原料农作物纤维下脚料森林和木材加工工业的下脚料工厂纤维和半纤维下脚料城市生活纤维物质.,思考题,1、发酵培养基的要求？配制培养基时应注意哪些问题？2、培养基的碳氮比对菌体的生长和产物形成的影响？3、淀粉水解糖有哪些制备方法？酸法和双酶法各有什么特点？、培养基、生长因子、前体物质、产物促进剂、DE值、接种量？,EndThanks!,
