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1、第八章 培养技术与过程建模,发酵控制目的,高的发酵水平生产过程的稳定成本控制,第一节 微生物发酵类型,分类依据一、投料方式不同：二、发酵与氧的关系三、菌体生长与产物合成之间关系四、代谢方式不同,一、投料方式不同1、分批发酵2、补料分批发酵3、连续发酵4、半连续发酵,第一节 微生物发酵类型,1、分批培养,是指在一封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式。特点：一次性投料，经灭菌、接种后，在发酵过程中不再补料，直到放罐。整个过程中菌浓、营养成分和产物浓度等参数都随时间变化。,分批发酵中微生物的生长,迟滞期,对数生长期,稳定期,死亡期,迟滞期：菌体没有分裂只有生长，细胞形态变大，菌种进入新环境
2、，细胞内核酸、酶等稀释，细胞不能分裂；对数生长期：细胞内与分裂相关的物质达到一定程度，细胞生长代谢活性最强，细胞开始分裂，呈几何级数增加；稳定期：培养液中营养物减少，废物积累，生长速率下降，生成率等于死亡率，细胞总数最高，细胞开始积累贮存物；死亡期：细胞死亡率大于生成率，有些细胞开始自溶。,对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累；而对于次级代谢产物，则在对数生长期后期和稳定期大量合成。,分批培养的优缺点,优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量易掌握缺点：产率低,2、补料分批培养,也称半连续培养、流加培养，它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法
3、。特点:一次或多次补入新鲜料液，延长产物合成周期，提高产量；只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比开始时有所增加。,补料的方式和控制,连续流加、不连续流加、多周期流加；快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加；单组分补料和多组分补料等。,杯式补料系统,补料分批培养的优缺点,基质浓度低，避免快速利用碳源的阻遏效应；避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏；避免分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的不良影响，降低发酵液粘度；维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,优
4、点：,缺点：,没有物料取出，产物的积累导致生产速率下降；染菌机会增加。,3、连续培养,发酵过程中，一边补入新鲜无菌料液，一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，菌体浓度、产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的，不随时间而变化。,连续培养的优缺点,优点：发酵条件稳定自动化程度高设备效率高设备使用寿命长易于优化发酵过程,缺点：,易引起菌种退化；染菌机会大大增加；对设备要求高菌体有挂壁和成团问题,杂菌污染问题 生产菌株突变问题,连续培养过程中的主要问题,杂菌污染问题,连续发酵过程中，需要长时间连续不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就不可避免地发生杂菌污染问题。杂菌污染问题
5、是连续培养中难以解决的问题。,生产菌株突变问题,微生物在复制过程中难免会出现差错引起突变，如果突变的结果使这一细胞获得在给定条件下高速生长的能力，那么它就有可能像杂菌一样，取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。,4、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液；四环素发酵常用。,半连续培养的优缺点,优点：放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释，有利于产物合成，提高产量。缺点：代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大。,1、需氧发酵：抗生素、氨基酸等；2、厌氧发酵：乙醇、丙酮、乳酸等。,二、发酵与氧的关系,啤酒发酵设备（厌氧发酵）,1、生长关联型发酵2、生长部分关
6、联型发酵3、非生长关联型发酵,三、菌体生长与产物合成之间关系,1、生长关联型发酵,产物直接来源于产能的初级代谢，菌体生长、糖的分解和产物的形成几乎是平行的；单细胞蛋白、葡萄糖酸的发酵。,产物的形成和菌体的生长相偶联,x,p,X（菌体）P（产物）,2、部分生长关联型发酵,第一阶段：菌体生长阶段；第二阶段：产物合成阶段。柠檬酸发酵。,产物的形成和菌体的生长部分偶联,x,p,X（菌体）P（产物）,3、非生长关联型发酵,第一阶段：菌体生长阶段；第二阶段：产物合成阶段。抗生素、氨基酸发酵。,产物的形成和菌体的生长非偶联,x,p,X（菌体）P（产物）,1、初级代谢产物发酵2、次级代谢产物发酵,四、代谢方式
7、不同：,初级代谢：生物细胞在生命活动过程中进行的与菌体的生长、繁殖相关的一类代谢活动。初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质，如氨基酸、核苷酸、乙醇、有机酸、多羟基化合物、糖类和维生素等。,注意事项,菌体进入发酵罐，其生长表现出：延迟期、对数生长期、静止期、死亡期等生长史的特征；对数生长期的菌种移植到与原培养基组成完全相同的新培养基中，就不会出现延迟期；为了缩短延迟期，宜接种对数生长期（中期）的菌种；为了获得代谢产物，菌体尚未达到死亡期即行放罐。,7.2 工业发酵过程的主要控制参数,微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件的控制。了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌
8、的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。,常规的发酵条件：,罐温搅拌转速搅拌功率空气流量罐压液位补料加糖、油或前体通氨速率以及补水等,条件控制,测定发酵过程中数据，以便对此过程进行有效的控制具体目的：过程变量与预期是否一致，决定种子罐移种时间与放罐时间，对不可测变量进行估计，手动或自动控制，计算机控制，收集数据,表征过程性质的状态参数：,pH、溶氧（DO）、溶解CO2、氧化还原电位、尾气O2和CO2 含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体浓度、菌浓等。间接状态参数：比生长速率、摄氧率、释放速率（CER）、呼吸商（RQ）、基质消耗速率和产物合成速率等。,表征过程
9、性质的状态参数：,物理测量：温度、压力、体积、流量等物理化学：pH、溶氧、溶CO2、氧化还原电位、气相成分分析等化学测量：基质、前体、产物等的浓度生物生化：生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分等提供反映环境和细胞代谢生理变化的许多信息,检测手段不同,直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等；间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等。,发酵参数测定方法的分类,离线检测：不安装在发酵罐内，人工取样 在线检测：自动测定，流动注射分析系统（FIA），（HPLC）或质普仪等原位检测：直接与发酵液接触，给出连续的响应信号，如温度、压力、pH、溶氧等，信号不受操作
10、者干扰，直接输入计算机,传感器,在线和原位检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。,一些生物传感器:,带计算机数据采集与控制的反应器,P188,原理：化学或物理信号 电信号 放大 记录显示仪 控制器（与设定参数比较）发出调节信号 控制器动作,一般监控系统,测定元件：如温度计、压力表、电流计、pH计，直接测定发酵过程各种参数，并输出相应信号。控制部分：将测定元件测出的各种信号与预先确定值进行比较，并输出信号指令执行元件进行调整控制。执行元件：接受控制部分的指令，开启或关闭有关阀门、泵等调节控制机构，使有关参数达到预定位置。,发酵是纯培养
11、过程，无菌要求高，对传感器有特殊要求：能经受高压蒸汽灭菌；结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）；对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）；性能要稳定，受气泡影响小。,几种常用的在线检测的传感器,pH电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极,实例pH测量,传统：pH试纸优点：方便，易操作。缺点：主观性较强；质量差异大，不同厂家不同批号的pH试纸测出的pH值差别有时甚至达0.51。,现代：pH电极,溶氧电极,温度传感器、耐高温pH和溶氧传感器,通气流量计,电 子 秤,压 力 传 感 器,蠕动泵补料测量与控制系统,流速调整幅度大(从0.1ml/h-
12、5L/h)，可变速蠕动泵，占空比可调整的开关控制。,数字式尾气氧和二氧化碳分析仪,用于过程分析的在线红外分析仪,带pH测控与补料控制的摇床,高效液相（HPLC）,分析代谢中间产物，通过中间代谢产物的测定，可以深入了解微生物代谢的流向，以此来分析代谢的情况，从而有的放矢的控制发酵过程。,发酵车间安装的质谱仪,与微生物发酵有关的参数,物理参数：化学参数：生物参数：,物理参数：,温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、粘度；,化学参数：,PH值、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、产物的浓度、废气中氧、二氧化碳的含量；,生物参数：,菌体浓度、菌丝形态,第三节 菌体浓度的影响及其控制,微生物如同一个
13、微小的容器，原料中的反应物透过微生物细胞周围的细胞壁和细胞膜进入微生物体内，把反应物转化为产物，接着这些产物又被释放出来；微生物是生物反应过程的催化剂，催化原料转化为有用的产品。,微生物的生长现象与繁殖方式,放线菌-无性孢子,微生物的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度（菌浓）：指单位体积的培养液中菌体的含量；一般：前期菌浓增长快，中期菌浓基本恒定，补料会引起菌浓波动，这是衡量补料量适合与否的一个参数。,生长的测定,微生物生长的测定，通常测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小。生长测定的常用理化方法，分为测定细胞数和细胞重量两类。,1、计数法,浊度计比浊法：
14、测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数；计数器计数法：在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数。,2、测定细胞重量,细胞干重称量法 直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量细胞堆积容积测量法 用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量 细胞组成分析法 测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间接地算出细胞重量,营养物消耗分析法 测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，间接表示细胞重量的生长 产物重量分析法 测定培养中途形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接地换算出细胞重
15、量的生长,菌丝形态也能反映菌生长情况,显微镜观察,第四节 营养基质的影响及其控制,发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。如：半乳糖苷可使大肠杆菌-半乳糖苷酶的产量增加1000倍；枯草杆菌既产淀粉酶，又产蛋白酶，提供葡萄糖，只产生蛋白酶。,黑曲霉柠檬酸发酵蔗糖浓度15%-18%，蔗糖同化率97%；蔗糖浓度20%，只同化92%；蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸；蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸。,一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种
16、工艺，后期的补料控制是关键。,一、碳源的影响和控制,迅速利用的碳源利于菌体生长；缓慢利用的碳源利于延长代谢产物的合成。,糖耗：反映产生菌的生长繁殖情况和产物合成的活力；糖含量测定包括：总糖：指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖：指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。,葡萄糖效应,大肠杆菌培养于含葡萄糖和乳糖的培养基中，出现两次生长旺盛期;菌先利用葡萄糖生长繁殖,葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖;即使加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的酶系也不能合成。,思考题,乳糖和葡萄糖，谁更适合作为青霉素发酵的碳源，为什么？,二、氮源的影响和控制,氨基氮：指有机氮中的氮（NH2-N），如氨基酸、黄豆饼粉、花生饼粉中的氮；氨氮：指无机氨中的氮（NH3-N）。,迅速利用的氮源利于菌体生长；缓慢利用的氮源利于延长代谢产物的合成,补氮工艺,补加有机氮源：土霉素玉米浆 青霉素尿素补加无机氮源：氨水、硫酸铵,磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此，磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施,三、磷酸盐的影响和控制,适合微生物生长的磷酸盐浓度：0.3300mmol适合次级代谢产物合成的磷酸盐浓度：1.0mmol,
