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1、基因启动子gene promoters,现代遗传学精要,New words,1、promoter prumut 启动子2、genetic expression dnetkkspre()n;ek-基因表达3、element elm()nt n.元素；要素；元件4、enhanser5、inducible indju:sbl adj.可诱导的；可导致的6、lactose operon lktus prn乳糖操纵子,主要介绍内容：,一、启动子结构的发现二、启动子的元件(promoter element)三、启动子的类型(promoter type)四、启动子的特点（Promoter character
2、istics）五、启动子的序列分析(Promoter sequence analysis),启动子,1、启动子：位于结构基因5端上游、能够指导RNA聚合酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNA序列。Promoter:located in the structural gene 5 upstream,can guide the RNA polymerase with template correctly,start a DNA sequence of the gene transcription,一、启动子的发现过程,Pribnow designed an experiment,he put
3、the RNA polymerase holoenzyme with prokaryotes template DNA binding,DNA hydrolysis with DNase,and then extracted with phenol,the precipitate purified DNA obtained after a protected RNA polymerase DNA fragment,about 41 44 nucleotide pairs.He has separated fd phage T7 bacteriophage A2 and A3 promoter
4、PR promoter of macrophages bacteria and E.coli lactose operon UV5 promoter paragraph 5 enzyme protected area,and sequence analysis later was done over 50 promoter sequence analysis revealed that,in the protected areas have a common sequence of five nucleotides,RNA polymerase closely integrated,now k
5、nown as the Pribnow District(Pribnow box),the center of the area is approximately located the starting point at the upstream 10bp,it is also referred to as the-10 region.Later found at-35 bp the the another common sequences(TTGACA),In eukaryotic genes,Hogness,etc.globin gene first discovered similar
6、 Pribrow zone Hogness zone(Hogness box),which is located upstream of the transcription initiation point at-25-30 bp the common sequence like TAAA,also known asas the TATA District.At-70-78 bp upstream of the start site Sterile another section of the common sequence of the CCAAT sequence correspondin
7、g with the the-35bp District prokaryotes.Called the CAAT area(CAAT the hox).,二、启动子元件,真核启动子中包含了许多调节基（regulator gene）转录的元件，它们控制着基因表达的强弱或者时空差异。根据对基因表达（genetic expression）的必须性，这些元件分为2类：核心启动子元件（core promoter element）和上游启动子元件(upstream promoter element),（1）TATA框(TATA box)：位于5端转录起始点上游约20-30个核苷酸的地方。TATA框是一个短
8、的核苷酸序列，其碱基顺序为TATAATAA。TATA框是RNA聚合酶的重要的接触点，它能够使酶准确地识别转录的起始点并开始转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的位置开始。（2）CAAT框(CAAT box)：位于5端转录起始点上游约70-80个核苷酸的地方。CAAT框是启动子中另一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为GGCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一个结合点，一般认为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当这段顺序被改变后，mRNA的形成量会明显减少。,1.核心启动子元件(core promoter element):指RNA聚合酶起始转录所
9、必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和 CAAT盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。,2.上游启动子元件(upstream promoter element):包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使得不同的基因表达分别有不同的时间与空间表达调控。这些上游启动子元件中，最普遍的是增强子元件。,3.增强子（enhancer）是一种能够提高同一条DNA链上基因转录效率的顺式调控元件。最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的
10、一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物和原核生物中都发现了增强子。增强子通常长100200bp，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为812bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。,病毒来源的35S启动子的结构,+9,-90,-343,Domain A,Domain B,Domain A:与在根部起作用有关。Domain B：是烟草转录因子ASF-1的结合部位，与在植物叶片、茎等绿色组织中起作用有关。,上游部分：与转录强度有关（增强子功能）。,含有重复的-343-90部分的35S启动子比350bp的35S启动子的强度大10倍。,35S启动子的核心长度为60bp左右
11、；其上游有其它元件，控制启动子的转录效率(Transcription efficiency)和特异性(specificity)，其中包括增强子(enhanser)。,增强子,11281 tttcccgcct tcagtttagc ttcatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac 11341 tcgccgtaaa gactggcgaa cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga 11401 aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca cacttgtcta ctccaaaaat atcaaaga
12、ta 11461 cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc 11521 tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag 11581 gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg 11641 ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 11701 ttc
13、caaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 11761 acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 11821 tggagagaac acgggggact cttgac,花椰菜花叶病毒35S启动子=CaMV35S启动子,TATA框(TATA box),CAAT框(CAAT box),三、启动子的类型：,1.组成型启动子(constitutive promoter)2.诱导型启动子(inducible promoter)3.特异
14、型启动子(tissue-specific promoter),1、组成型启动子,CaMV 35S 启动子是一个病毒来源的组成型启动子（constitutive promoter），不仅可以能在双子叶植物中高效启动基因表达，而且在许多单子叶植物中也可以高效启动基因表达。另外 CaMV 35S 启动子内部没有我们常用的酶切位点(Restriction Enzyme cutting site)，因而容易克隆和使用，在植物基因工程（genetic engineering）中得到了广泛的应用。,茎,叶片横切面,根,花,幼苗,35S 启动子控制的GUS基因在烟草中表达,.植物来源的组成型启动子,在植物中有
15、很多看家基因，在各种类型细胞和所有时间内都表达。启动这些基因表达的启动子就是组成型启动子。现在许多这类启动子已经被克隆，并在植物基因工程得到了应用。肌动蛋白（actin）是细胞基本骨架的成分，actin基因家族的基因都是组成型基因，其启动子就是组成型启动子。通过检测报告基因的表达，发现1.5kb的拟南芥actin2基因启动子几乎在拟南芥所有器官和整个发育过程中都起作用，仅在种皮、胚轴、子房和花粉囊中不起明显作用。水稻的actin1基因启动子仅不在木质部中起作用。,拟南芥ACTIN2基因启动子分析,原核生物组成型启动子之二：农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子 Nos promoter,Nos prom
16、oter,35S promoter,Nos promoter,烟草,卫矛,2.诱导型启动子（Inducible Promoters）,1.Stress/wound-inducible promoters：病原菌、害虫、低温、高温、水涝、干旱、高盐、创伤等都可以引起植物的一些特殊反应（基因表达的结果），由此而得到一些受这些因素诱导的启动子。马铃薯创伤启动子 wun1（创伤启动子）and proteinase inhibitor II(pin2，蛋白酶抑制剂)gene promoters both direct high wound-and pathogen-inducible expressio
17、n,but have little to no constitutive expression without stimulus。The 1.2 kb wun1 promoter fused to reporter genes showed very high levels of expression at the site of wounding and pathogen attack。Reporter gene induction was maximal at 10 h.The Arabidopsis rd29A and rd29B基因启动子受到干旱、高盐的诱导。,2.外源诱导启动子,优点
18、：1）可以随意控制（诱导时间和诱导的剂量）；2）重复控制；3）植物内部背景低。Most inducible/repressible promoter systems are two-component systems with molecular on-off switches that vary in complexity.They include a transcription factor gene whose product,when selectively expressed,binds to a target promoter that contains the transcrip
19、tion factors cis-acting element.The target promoter is fused to the transgene of interest and the binding of the transcription factor modulates its expression,35S启动子,转录因子基因,转录因子,+诱导剂（Cu2+,酒精,等),基因表达,外源诱导启动子系统作用示意图,结合,转录,功能基因,诱导型启动子,乙醇诱导系统:The alc system is extremely sensitive to ethanol and is induc
20、ed rapidly and in a dose-dependent manner.The target gene is induced by soil root drenching(0.5%v/v ethanol),hydroponics(0.1%v/v ethanol),and foliar spraying of mature plants(5%v/v ethanol).It has low to no basal expression of the target gene,and it has the advantage of an inducer that is inexpensiv
21、e and nontoxic at the effective concentrations.Induction of target gene expression was similar to that of genes driven by the CaMV 35S promoter,but was reversible.One drawback is that under anaerobic conditions,plants that are known to express alcohol dehydrogenase are likely to activate this system
22、 with the production of ethanol,a fermentation metabolite.However,this system appears to be one of the most promising for use under field and commercial conditions.,Tetracycline and hormone-inducible systems（四环素和激素诱导系统）,包括Tetracycline(四环素)inducible system,estrogen(雌激素)inducible system,ecdysone(蜕皮激素)
23、inducible system,和glucocorticoid(糖皮质激素)-based system.,（1）、组织特异启动子（tissue-specific promoter）（2）、块根/块茎储藏器官特异启动子（3）、果实特异性启动子（4）、花粉/花药特异启动子（5）、根特异启动子（6）、花/花序特异启动子(7)、叶片/绿色组织特异启动子（8）、细胞器特异启动子,3.特异启动子,（1）组织特异启动子（tissue-specific promoter）,植物维管组织特异启动子,（2）根特异启动子,Agrobacterium rhizogenes rolD 基因启动子（373-426bp）
24、、90bp的35S启动子具有根特异性；烟草的TobRB7启动子、Arabidopsis thaliana pyk10启动子、松树PmPR10-1.14启动子。,(A)2-day-old seedling;(B)3-day-old seedling showing GUS-staining throughout the whole plant,with exception of the elongation zone of the root;(C)5-day-old seedling with a reduction of gus-activity in cotyledons;(D)7-day-
25、old seedling showing that the hypocotyl is no more stained;(E)10-day-old seedling with no GUS-staining in the upper parts of the plant;(F)14-day-old seedling;(G)stained roots showing gus-activity along the whole main root;(H)transition zone between hypocotyle and root.(IT)Gus-activity under control
26、of the promoter construct C,(I)2-day-old seedling;(K)3-day-oldseedling;(L)5-day-old seedling;(M)7-day-old seedling without GUS-staining in the hypocotyl;,(N)10-day-old seedling showing GUS-staining in cotyledons,in the midrib region and marginal parts of the leaves and in hydathodes;(O)14-day-old se
27、edling with a strong reduction of gus-activity in the upper part of the plant;(P)stained roots showing a strong gus-activity along the whole main root;(Q)close-up of stained roots showing gus-activity preponderantly in the central region of the root or in the whole root;(R)close-up of a stained root
28、 showing gus-activity in the outer parts of the root;(S)close-up of stained root tips and root hairs;(T)lateral roots with GUS-staining only in the root tip;(UW)stained cross sections of main roots;(X)stained cross section near the root tip;(Y)close-up of a pod abscission site.,（3）.果实特异性启动子 果实是食用器官，
29、利用果实特异性启动子可以改良果实品质、生产疫苗。苹果和番茄果实中1-aminocyclopropane-1-carboxylate(1-氨基环丙烷-1-羧酸，ACC)oxidase gene（E8 gene）和polygalacturonase(多聚半乳糖醛酸酶，PG)genes 启动子在果实成熟是起作用。番茄PG启动子用来提高番茄果实中胡萝卜素的含量；番茄E8启动子表达virus-F protein，生产疫苗，提高了老鼠系统免疫能力。,（4）叶片/绿色组织特异启动子,属于光诱导型启动子 研究最清楚的是编码 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase（1，5-二
30、磷酸核酮糖羧化酶）小亚基的 rbcS multigene family的启动子。另外，chlorophyll a/b-binding(Cab)protein genes的启动子.。,（5）.花粉/花药特异启动子,烟草花粉(pollen)特异启动子 TA29,番茄花粉特异启动子 lat52，水稻花粉特异 RA8 gene启动子、玉米ZmC5基因启动子、ZM13启动子都是花粉特异启动子.花粉特异启动子被广泛用来创造核雄性不育植物(Nuclear male sterile plants)。花粉特异启动子barnase(RNase)载体(vector)已经用来转烟草、油菜、水稻、玉米等；花粉特异启动子
31、还可以进行基因删除，防止外源基因(exogenous gene)通过花粉污染其它非转基因植物(Non transgenic plants)，提高转基因作物的生物安全性。,（6）细胞器特异启动子,叶绿体基因工程：在叶绿体表达外源基因。优点：1）叶绿体基因组小，没有位置效应，转基因不会沉没；2）表达量高，可以达到10000叶绿体/细胞；3）花粉中没有叶绿体，所以没有基因逃逸，安全。Chloroplast transformation vectors most often include a light-responsive promoter psbA,a photosystem II promot
32、er，and rbcL,the promoter for the ribulose-1,5-bisphophate carboxylase large subunit gene,and the 16S rRNA(Prrn),a strong and constitutive plastid operon promoter.,（7）块根/块茎储藏器官特异启动子,B33 and PAT 21是土豆的糖蛋白的主要成员，分析表明B33 and PAT 21基因的表达最主要是在块茎形成的过程中，表明B33 and PAT 21基因的启动子是块茎特异性的。Sporamin（红薯特殊贮藏蛋白）and-淀粉酶
33、是红薯块根中2个主要的可溶性蛋白，研究表明Sporamin 几乎都在块根中表达（1%4.5%在茎中)。,（8）.花/花序特异启动子,花是重要的观赏器官，花色、花形、花的寿命和香气等是花卉重要性状。1.45 kb的菊花内源ubiquitin extension protein 基因启动子(UEP1)在花中的作用是在叶片中作用的9倍，比 CaMV 35S启动子在菊花中的作用高 4085倍。控制拟南芥花瓣中蜡质合成的基因（CER6）启动子也可以在菊花花瓣中特异起作用。拟南芥leafy,ap1,ap3，PI 等花器官发育基因的启动子,启动子的特点,序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常含有几个保守的
34、序列框，序列框中碱基（base）的变化会导致转录启动活性的改变。方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控元件，有单向启动子和双向启动子两类。位置特性。启动子一般位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。处于基因的下游或在基因的上游但离所要启动的基因太远的启动子，一般都不会起作用。种属特异性。原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动子。但一般来说，亲缘关系越近的两种生物，其启动子通用的可能性越大。,四、基因启动子的序列分析,以拟南芥GH3基因家族启动子序列分析为例：步骤：1、启动子序列的确定,在拟南芥资源信息网（http：/www.arabidopsis.arg）获得19个GH3
35、基因的全长mRNA序列，利用NCBI在线搜索工具（www.ncdi.nlm.nih.gov）分析这19个基因与上游基因之间的间距，对间距大于2000bp的GH3基因，利用BLAST在线服务寻找其基因序列，对翻译起始密码子上游2000bpDNA序列进行启动子序列分析,Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶(RNA polymerase holoenzyme)与原核生物(prokaryote)模板DNA结合后，用DNase 水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段(segment)，约有4144个核苷酸对（nucleotide）。他先后分离了fd
36、噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动子（promoter）、h噬菌体的PR启动子及大肠杆菌乳糖操纵子（lactose operon）的UV5启动子等5段被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列（consensus sequence)），是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。后来在-35 bp处又找到另一个共同序列（TTGACA）。,在真核生物（eucaryon）基因中Hogness等先在珠蛋白基因（globin gene）中发现了类似Pribrow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录（transcription）起始点上游-25-30 bp处的共同序列似TAAA也称为TATA区。另外，在起始（initiation site）上游-70-78 bp处还育另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中-35bp区相对应的序列称为CAAT区（CAAT hox）。,
