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1、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?,在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?,答:这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。,化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,
2、第五章 基因的重组与转移,载体去磷防止连接反应中的载体自连,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,2Pi,寄主修复缺口,载体自连或产生二具体等,2、目的基因与载体的连接,一、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,第一节 DNA片段的体外连接,1.两段DNA的连接,依靠粘性末端,2.DNA片断与载体的连接,依靠粘性末端,二、齐平末端（blunt end）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1.直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性
3、末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。,（1）同聚加尾 法,2.人工加尾形成“粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接,linker,用
4、化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：,linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylinker:,优点：,（3）DNA接头(adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。,adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。,ad
5、apter的作用,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG-GGCC-,-CCGG-GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG-GGCC-,CCGG GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,5p-GATC
6、CCGG-OH HO-GGCC-P,P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！,5GATCCCGG-OH HO-GGCC5,5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5GATCCCGG-HO-GGCC,CCGG-OH-GGCCCTAG5,5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 li
7、gase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,5,
8、复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAGCCGG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,CGATCGGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAG,PCR产物,-5,3-,G,C,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2.与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）
9、。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,决不能进行非粘性末端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2.DNA插入的方向正确,用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3.插入基因的
10、开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重组,但移码突变！,4.防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,1.载体自身环化连接,2.载体之间互相连接,3.插入片段互相连接,4.一个载体与几个插入片段重组,五、载体和外源DNA插入片段的连接结果,5
11、.几个载体与一个插入片段重组,（能存活）,（能存活）,（不能存活）,（能存活）,（能存活）,17,黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。,黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。,1.目的,增加受体菌细胞膜的通透性。,第二节 重组体导
12、入细菌细胞,一、感受态大肠杆菌的制备,感受态：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,3.制备原理,该法是197年Mande和lHiga发现的，并且1972 Cohen 做实验进一步验证。其转化效率为每微克质粒DNA可以获得5106-2107的转化菌落。,转化的可能原因为：在0的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细胞膜的外表面上，当42 热击短暂
13、处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供进入细胞的通道。,4.制备过程,培养大肠杆菌,OD600至,On ice 5-10 min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（2）转染（transfection),大肠杆菌捕获裸露的噬菌体DNA的过程。,1.外源DNA导入细菌的几种方法,（3）转导（trans
14、duction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,每gDNA转化成功的细菌克隆数。,3.转化方法,2.转化率,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,（1）热休克法（heat shock）,转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,DNA分子转化受体菌获得转化子的效率,10ng载体DNA,100L感受态菌,On ice混合，静置10分钟,42C 1分钟,加入1mL LB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热休克法,LB培养受体菌至OD600,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的水
15、重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成 50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,（2）电转化法,电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等成功的用于大肠杆菌的转化。其原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促使外源DNA的有效吸收。电穿孔转化的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA的浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到1091010转化子
16、。电压增大或脉冲时间延长均将提高转化效率，但受体细胞的存活率降低。,4.平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,环形重组质粒 质粒自我连接,线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。,环形质粒数,（1）重组质粒,5.影响转化率的因素,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（2）感受态细胞（competent cells),转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其
17、他酵母接合）。,第三节 外源基因导入真核细胞,一、导入酵母细胞,1.菌株选择,如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31,（1）利用原生质球进行转化,2.酵母的转化方法,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,插入外源基因 的酵母载体,CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,酵母,0.1mol/L LiCl处理,插入外源基因的酵母载体,感受态,40%PEG 4000,（2）利用Li+盐进行转化,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入，还可使细胞膜之间以及细胞膜与DNA之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连。,叶盘,消
18、毒,切取,土壤农杆菌浸泡,看护培养基,愈伤组织,分化幼苗,二、导入植物细胞,1.叶盘法（leaf disk),植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,1-2kV,3-25F电击,愈伤组织,幼苗,分化,2.电击法（electroporation),又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles),DNA,1.2m钨或金弹头,吸附,特制手枪,射击植物,装入,利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基因转化方法,DNA颗粒载体的制备：用cacl2沉淀DNA以及用亚精胺、聚
19、乙二醇的黏附作用进行的,其它几种方法,花粉管介导法,种子浸泡法-种子吸水时将外源基因携入种子胚中,穗鞘腔浸泡法-迫使卵母细胞吸收外源DNA,脂质体转化外源基因-通过胞融合或胞吞作用,超声波处理法激光以及PEG法等等,（1）原理：,三、导入哺乳动物细胞,1.磷酸钙沉淀法,HEPES缓冲盐水(羟乙基哌嗪磺酸)与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,1973年 Graham F.L.,不需要载体。,（2）特点：,1、将待转染的外源DNA同cacl2 混合制成cacl2 DNA溶液,2、在不断搅拌过程中，逐滴
20、加入磷酸钙溶液，形成磷酸钙和DNA共沉淀,3、然后，直接用吸管仔细转移共沉淀，使之粘附到培养的哺乳动物单层细胞表面，就会迅速地被细胞捕获。,据报道，添加甘油或二甲基亚砜会增加某些细胞吸收外源DNA的数量,脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。,2.脂质体（lipofectin）载体法,脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。,脂质体是一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔。,内部水腔,双层膜,我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。1.细胞的状态
21、。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更
22、大了，死亡细胞会增多。4.加入无血清培养基后56小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒，我做的结果都不好。6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。,直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,3.显微注射法(microinjection),二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖简称DEAE-葡聚糖它是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。,4.DEAE-葡聚糖传染法,吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。,其机理可能是（1）DEAE-葡聚糖同DNA结合成复合物，可以保护DNA免受合算酶的降解作用；（2）DEAE-葡聚糖可以同细胞膜发生作用，从而使DNA能够容易地穿过细胞表面进入细胞内部,DEAE-dextran,细胞,外源DNA,预处理,摄入,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,DEAE-dextran对细胞有毒!,外源基因导入细胞的方法,18,
