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1、第三章 基因变异与重组第一节 突变类型和基因符号 第二节 基因突变的规律 第三节 自发突变的机制第四节 诱变剂及其作用机理第五节 突变生成过程,第一节 突变类型及基因符号,定义1：突变是指生物表型突然发生的可遗传的变化。,定义2：突变是指生物生长过程中，由于内因或外因的作用导致染色体DNA结构或数量发生的改变。,突变体：带有突变基因的细胞或个体,突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。,诱发突变的频率要远远高于自发突变频率.,一、突变类型,（一）、按突变发生原因分类,自发突变(spontaneous mutagenesis)：未经任何人为的处理而自然地发生的突变
2、，称为自发突变。,诱发突变(induced mutagenesis)：由人们有意识地利用物理或化学手段引起的突变称为诱发突变。,突变可以发生在染色体水平或基因水平，发生在染色体水平的突变称为染色体畸变，发生在基因水平的突变称为基因突变。,（二）、按变化范围分突变类型,1)整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组单倍体：haploid二倍体：diploid三倍体：triploid四倍体：tetraploid,1 染色体畸变（chromosome aberration),染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。,(1)染色体数目的变化,单体（二倍减一，monosomic dipl
3、oid):2n-1缺体（二倍减二，nullisomic dilpoid):2n-2三体（二倍加一，trisomic diploid):2n+1四体（二倍加二，tetrasomic diploid):2n+2双二倍加一（double trisomic）:2n+1+1部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片 段所构成的不完整二倍,2)非整倍体aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员 的增加或减少。,涉及到DNA分子上较大范围的变化，往往会涉及到多个基因。,(2)染色体结构的变化,染色体结构的改变，多数是染色体或染
4、色单体遭到巨大损伤产生断裂，而断裂 的数目、位置、断裂端连接方式等造成 不同的突变.,包括染色体缺失、重复、倒位和易位等,d-相互易位,a-缺失,b-重复,c-倒位,缺失deficiency：是染色体片段的丢失。细胞学效应：缺失环遗传学效应：这种突变往往是不可逆的损伤，其结果会造成遗传平衡的失衡。,重复repetition：是染色体片段的二次出现。细胞学效应：重复环遗传学效应：这种突变有可能获得具有优良遗传性状的突变体。,倒位inversion：是指染色体的片段发生了180的位置颠倒细胞学效应：倒位环遗传学效应：造成染色体部分节段的位置顺序颠倒，极性相反。,易位translocation：是指
5、一个染色体的一个片段连接到另一个非同源染色体上。相互易位reciprocal translocation：两个非同源染色体间相互交换一部分。相互易位的细胞学效应：十字型图象,点突变point mutation：单碱基对的置换突变发生在一个基因范围内。多位点突变：突变超出一个基因范围。,(2)基因突变（gene mutation）,基因突变是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几 对核苷酸的缺失、插入或置换，分为碱基置换和移码突变。,根据染色体局部座位内的变化范围,(2)颠换transversion：DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被一个嘧啶（嘌呤）所置换。,1、碱基置换bas
6、e pair substitution,DNA链上一个碱基对为另一碱基对所取代叫碱基置换,(1)转换transition：DNA链中一个嘌呤（嘧啶）被另一个嘌呤（嘧啶）所置换。,一般只引起一个基因的表达出现错误。,2、移码突变frameshift mutation,在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和转译错误的突变叫移码突变。,同义突变（synonymy mutation）和沉默突变（silent mutation）。,（三）按突变是否引起遗传编码特性的改变分类,一类是引起遗传性状改变：,错义突变（missense muta
7、tion），无义突变（nonsense mutation）和移码突变,一类不改变遗传性状的突变,移码突变frameshift mutation:在DNA序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和转译错误的突变。,错义突变missense mutation：突变后的密码子代表另一种氨基酸。个别碱基的 改变导致多肽链上某个氨基酸为另一种 氨基酸所取代。例：GGC突变为AGC，编码的氨基酸由甘氨酸变成色氨酸。,无义突变nonsense mutation：突变后的密码子代表终止密码。例：AAG（亮氨酸）突变为UAG（终止密码子）。,沉默突变：表型
8、不发生改变的基因突变。包括同义突变和氨基酸序列发生改变而不影响蛋白质功能的错义突变。,同义突变：突变后的密码子编码的仍是同一种氨基酸。碱基序列发生改变而氨基酸 序列未发生改变的隐蔽突变。例：ATT突变为ATC，两者都编码异亮氨酸。,同义突变的发生是由于遗传密码的简并性。,同义突变不会导致编码特性的改变，但往往会引起限制酶切割位点的变化，造成 DNA限制片段长度的多态性,Tyr酪氨酸 UAG:琥珀型(Amber,Am)UAA:赭石型(Ochre,Och)UGA:乳石型(Opal,Opal),野生型wild type：表现该物种正常表型的生物。突变型mutant：由于突变导致其正常的表型发生了改变
9、的生物。,（四）、按突变的表型变化效应分类,1.形态突变型morphological mutant：引起细胞个体形态和菌落形态发生改变的突变型。是一种可见突变。,2.生化突变型：引起特定生化功能的丧失而无形态学效应的突变型。包括营养缺陷型、抗性突变型、糖代谢突变型等。,营养缺陷型auxotrophic mutant：由于代谢过程的缺陷而不能合成某种与合成初级代谢物有关的 基因产物的缺陷型。抗性突变型resistant mutant：由于基因突变而产生的对某种化学药物、致死物理因子或噬菌体 具有抗性的变异菌株a)抗药物突变型：对原本敏感的药物具有一定的耐性。b)抗噬菌体突变型：对原本敏感的噬菌体
10、产生抗性。,3.致死突变型lethal mutant：由于基因突变造成个体死亡的突变型。杂合状态的显性致死和纯合状态的隐性致死都导致个体的死亡,4.条件致死突变型condition lethal mutant：在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。如：温度敏感突 变型temperature-sensitive mutant,6.产量突变型metabolite quantitative mutant:所产生的代谢产物的产量明显有别于原始菌株的突变株称产量突变型,5.调节突变型regulatory mutant：丧失对某一基因或操纵子表达能力调节的突变型。,突变类型,按突变
11、发生原因分,自发突变诱发突变,按变化范围分,染色体畸变,数目的变化:整倍体/非整倍体,结构的变化:缺失、重复、倒位和易位等,基因突变,碱基置换:转换/颠换,移码突变,点突变/多位点突变,按是否引起表型的改变分,引起遗传性状改变:错义突变/无义突变/移码突变,不改变遗传性状的突变:同义突变/沉默突变,按突变的表型变化效应分,形态突变型生化突变型:营养缺陷型/抗性:抗药物/噬菌体致死突变型条件致死突变型调节突变型产量突变型,二 基因符号,基因命名原则1966年M.Demerec等提出,TIG遗传命名指南提出基因的名称由该基因突变后的表现型效应来命名,每一基因座位（locus）用三个斜体小写英文字母
12、表示，它们来自说明这一基因特性的一个或一组英文单词的前三个字母；如lac(lactose),his(histidine)；rps(ribosomal protein small subunit),rim(ribosomal modification)产生同一突变型表型的不同基因，在三个小写字母后用不同的一个大写斜体字母来表示；如trpA,trpB同一基因的不同突变位点（mutation site）在基因符号后用阿拉伯数字表示。如trpA23突变型的基因符号用基因座符号加上加/减号（“+/-”）或其 他符号(“r/s”)来表示。如leu+，his-;strr基因表型和产物用相应基因型的正写字母表
13、示，其中第一个字母大写。如lacZ-LacZ-,突变的特征,第二节 基因突变的规律,自发性,随机性,稀有性,独立性,可诱变性,可遗传性,可逆性,(一)突变的特征,说明：E.coli 对噬菌体的抗性是在接触噬菌体之前的细胞分裂过程中自发产生的。,波动实验,1943，Luria&Delbrck设计,突变的自发性,1952，Lederberge夫妇设计,影印培养实验,直接证明抗药微生物的产生是自发产生的，与链霉素的使用无关；链霉素只是起到筛选作用。,基因突变的发生从时间、个体、位点和所产生的表型变化等方面都带有比较明显的随机性。,突变的随机性,突变总是以一定的频率在群体中发生,5-甲基胞嘧啶（MeC
14、）的存在发生DNA上短的连续重复序列处突变热点也还与诱变剂有关,突变热点（hot spots of mutation）,DNA分子上各个部分有着不同的突变频率，某些位点的突变频率大大高于平均 值，这些位点称为突变热点,形成突变热点的最主要的原因,突变的稀有性,抗药性突变以一定的突变率发生在个别细胞中。正常情况下，突变发生的频率往往很低。,突变率（mutation rate）：指在一个世代或其他规定单位时间，在特定环境条件下，一个细胞产生某一性状突变的概率。也可指某一群体在某一世代（即分裂一次）产生的突变菌株数目。,基因自发突变概率在10-9-10-6，转座突变在10-4，无义错义突变概率在10
15、-8,细胞分裂非同步性教正：突变率=ln2m=0.69m,突变率（m）的计算,固体平板法测突变率：m=(M2-M1)/(N2-N1),液体培养法测突变率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1),液体稀释法测突变率：P0=e-mN,细菌数N突变数M分裂次数g突变率m突变试管与总试管数比值P0,分裂次数 0 1 2 3 4细菌总数 N 2N 4N 8N 16N原有突变型数M=mN 2mN 4mN 8mN 16mN新增加突变型数 mN 2mN 4mN 8mN突变型/野生型(1/2)m m(3/2)m 2m,液体培养中细菌数和突变型数的关系,分裂g次后的比数是(1/2)gm,液体培养法测突变
16、率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1),例：在20个试管中有11个试管不含任何突变型细菌，每一试管的平均细菌数N测得是5.6108,P0=e-mNP0=11/20=0.55m=-ln P0/N=0.6/(5.6 108)=1.2 10-8,两类增变基因：一类是DNA聚合酶的各个基因一类是dam基因和mut基因,增变基因（mutator gene）,当生物体内有些基因突变时，整个基因组的突变频率明显上升。这些基因称为增变基因,增变基因的突变导致突变频率的大幅提升,在大肠杆菌中，到目前为止已发现有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶、和，都与DNA链的延长有关。DNA复制中起主导作用
17、的是DNA pol,1聚合作用：235外切酶活性校对作用：353外切酶活性切除修复作用,拓展阅读：DNA聚合酶,突变的独立性,一个基因的突变不受其它基因突变的影响，两个不同基因同时发生突变的频率为两个基因各自的突变率的乘积。,交叉抗性,产生原因：作用2种或以上结构类似的抗生素或作用机制近似抗生素，从而表现为交叉抗性。,拓展阅读：抗生素的抗性机理,自发突变的频率可以通过某些理化因素的处理而大为提高。高幅度为101105倍 基因突变的可诱发性是诱变育种的基础,突变的可诱导性,突变基因和野生型基因一样是一个相对稳定的结构，通过复制传递给子代DNA 突变基因所表现的遗传性状也是一个稳定的性状,突变的可
18、遗传性,突变的可逆性,真正的原位回复突变，可使突变基因回复到野生型基因完全相同的DNA序列,第二点的回复突变(抑制突变suppressor mutation)第二点的回复突变并没有改变突变的DNA碱基序列，只是其突变效应被抑制了.大多数回复突变都是第二点突变抑制了第一次突变造成的表现型(表型抑制),基因内抑制：抑制突变发生在正向突变基因内；基因间抑制：抑制突变发生在其他基因之中；,抑制突变的类型,根据作用位置分：,直接抑制突变：通过恢复或部分突变基因蛋白质的功能；间接抑制突变：通过改变其他蛋白质的性质或表达水平而补偿原来突变造成的缺陷，从而使野生表型得以恢复。,根据作用方式分：,鉴定：重组实验
19、。由于抑制突变发生位置很近，鉴定困难，DNA序列分析或蛋白质序列分析。,基因内抑制突变,基因内抑制突变：,错义突变可通过基因内的另一处突变使蛋白质功能得到恢复。,移框突变的基因内抑制突变：,可通过基因内第二点基因插入或基因缺失使蛋白质功能得到恢复。,Ser Glu Thr Met Phe ThrAGG GAG ACU AUG UUU ACG,野生型：,G,Ser Glu Asp Tyr Val TyrAGC GAG GAC UAU GUU UAC G,突变型：,Ser Gly Thr Met Phe ThrAGC GGG ACU AUG UUU ACG,去除A,Ser Glu Asp X Ph
20、e ThrAGG GAG GAC UAG UUU ACG,去除U,需要琥珀抑制tRNA,正向突变的无义突变、错义突变和移框突变可被另一基因上的突变所抑制，分别称为无义抑制突变，错义抑制突变和移框抑制突变。这些突变均发生在tRNA或与tRNA功能有关的基因上，这些基因又叫抑制基因。,基因间抑制突变,UAG抑制tRNA：琥珀型（amber）抑制突变UAA抑制tRNA：赭石型（Ochre）抑制突变UGA抑制tRNA：乳石型（Opal）抑制突变,(1)基因间无义抑制突变,温度敏感抑制突变：许多amber突变抑制tRNA表现出温度敏感性，即30能产生对amber突变表型抑制，而在42则不能产生这种效应。
21、,（2）基因间错义抑制突变：tRNA的反密码子的改变,例如：GGA（Gly）AGA（Arg）如果甘氨酸tRNA反密码子也由UCCUCU，则仍能在相应处安插一个Gly，如果安插的不是Gly，而是其他氨基酸，只要能使蛋白质功能部分恢复，都表现出错义抑制效应。,（3）基因间移框抑制突变:,tRNA反密码子上增加或减少一个碱基。,第三节 自发突变的机制,转座因子（Transposable element TE）,细胞基因组中能够从一个位置转移到另一个位置的一段DNA序列。,几乎所以生物都有转座因子存在,转座因子类型,按照结构和遗传性质分三类插入序列（insertion,IS）比较短，转座酶基因TnP、
22、颠倒重复序列（IR）转座子（transposon,Tn）分子量较大，转座酶基因、标志基因（抗生素或金属抗性基因，产细菌毒素基因，某些糖发酵基因）复杂转座子、复合转座子转座噬菌体（Mu噬菌体，mutator phage）没有特定的整合位置生物诱变剂,DNA分子的运动,1）环出效应,2）碱基的互变异构作用,T和G可以酮式或烯醇式两种互变异构状态，而C 和A可以以氨基式和亚氨基式两种状态存在,5mC同样易于自发脱氨基转变为胸腺嘧啶T,子代DNA发生GCAT的突变,自发脱氨氧化作用,胞嘧啶C氧化脱氨基自发地变成尿嘧啶U 而形成错配的碱基对,DNA的复制差错,源于DNA聚合酶产生的错误DNA分子运动而造
23、成碱基配对错误修复系统的各种缺陷所导致的结果,第四节、诱变剂及其作用机理,凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂三大类。一、物理诱变剂二、化学诱变剂三、生物诱变剂,一、物理诱变剂,物理辐射可分为电离辐射和非电离辐射，电离辐射是一切能引起物质电离的辐射总称;带电粒子有粒子、粒子、质子，不带电粒子有中子、X射线、射线。非电离辐射是指能量比较低，并不能使物质原子或分子产生电离.紫外线、红外线、激光、微波都属于非电离辐射。,(一)电离辐射,电离辐射：当量子能量达到120eV 以上时,对物体有电离作用,能导致机体的
24、严重损伤,这类辐射称为电离辐射 常用于微生物诱发突变的电离辐射有快中子、X射线和射线等。,电离辐射的作用机制还不能做出圆满解释。存在两种假说，即所谓的直接物理作用假说与间接化学作用(辐射裂解水分子产生自由基而起作用)假说。,电离辐射主要引起DNA上的基因突变和染色体的畸变；,1、电离辐射的作用机制,2、电离辐射的剂量,快中子的剂量通常以拉德（rad）表示,在诱变育种中快中子照射的致死率达到50%-85%比较合适，采用的诱变剂量大约在15-30krad（千拉德）。不同种类菌种最适当剂量范围是不同的。,1rad=100erg/g=0.01J/kg=0.01Gy。,X射线和射线的剂量通常以伦琴(R)
25、来表示,由于X射线和射线穿透能力很强，对细胞致死作用比紫外线和一般的化学诱变剂表现更为强烈，因此，它们不适宜像紫外线那样进行反复多次照射。一般常用的剂量掌握在杀菌率90-99.9为宜，切忌用高剂量进行处理。,1cm3干燥空气征0，1.013105Pa(760mmHx气压下)产生2.08x109离子时所需的能量。,直接对平皿上生长的菌落进行照射，或者用直径6-10mm的打孔器把菌落连琼脂一同取出，置于灭菌平皿内进行照射；也可制成菌悬液，取1-2mL置于试管内并浸入冰水中，从上或侧面或下向进行短时间照射。试管内的菌悬液不宜过多，否则液层太厚，氧气供给不足，诱变效应和重复性都将比较差。处理完毕后，把
26、盛有菌体细胞的试管继续冰浴2-3h。低温可降低或抑制修复酶的活性，防止突变体因修复酶的修复而还原为正常细胞。这一操作除用于射线外，也可用于紫外线和其他化学诱变剂，可以获得同样的效果,3、电离辐射的照射方法,非电离辐射：当量子能量小于 120eV 的不足以引起生物体电离的电磁辐射，称为非电离辐射 常用于微生物诱发突变的非电离辐射有：(1)射频辐射。射频辐射称为无线电波,量子能力很小。按波长和频率,射频辐射可分成高频电磁场、超高频电磁场和微波 3 个波段。(2)红外线辐射。(3)紫外线辐射。,（二）非电离辐射,非电离辐射主要导致形成嘧啶二聚体。同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与每种微生物修
27、复系统的强弱有关。它们引起微生物的变异或死亡与辐射剂量成正比。,1、非电离辐射的作用机制,2、紫外线的作用机制,(1)紫外线的有效光谱 紫外线的光谱范围在40-390nm，能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是200-300nm。最有效的波长为253.7nm。一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范围广，较平均，诱变效率较差。而15W紫外灯管，放射出来的紫外线大约有80%波长集中在253.7nm，因此诱受效应比30W的好。,3、紫外线诱变的方法,(2)紫外线的辐射剂量 用于微生物诱变的紫外线剂量的表示方法，可分绝对剂量和相对剂量。绝对剂量需要用一种剂量仪来测定，由于操作比较困难，在诱变育
28、种的实际工作中不常被采用。相对剂量单位用照射时间或者杀菌率表示。根据育种工作者长期的研究和实践经验，一般认为杀菌率以90%-99.9%效果较好。但也有报道，认为较低的杀菌率有利于正突变菌株的产生，以70%-80%或更低的杀菌率为好。,紫外线照射剂量与杀菌率在一定范围内成正比，剂量越高，杀菌率也越高，在残存的细胞中变异幅度也广；反之剂量越低，杀菌率也越低，在残存细胞中变异幅度也小。因此，在照射过程中可加大剂量，但又要采取减少死亡率和提高诱变效果的措施。使用诱变效果好的低功率15W紫外灯管2支，并安装在放光的灯罩内，使253.7nm光波集中到被处理的微生物细胞上，可以提高变异率。另一种办法是把照射
29、剂量提高到超致死量的程度，与可见光交替进行，利用光修复使损伤的细胞恢复，减少死亡率，增加变异幅度。一般采用30W紫外灯管，光复活的效果较好，或者在预培养基中增加一定量的咖啡因或蛋白陈，也可以降低此亡率。,(3)紫外线诱变的步骤与方法：1)出发菌株，把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。2)前培养，对细菌类以肉汤为主，适量加入核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，同时还可加入抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟胺等。将菌体培养到最佳生理状态(对数期)，约16-24h；霉菌、放线菌培养到绝大部分孢子刚刚萌发。,3)制备菌悬液，离心除去培养基，用生理盐水制备菌悬液、加入玻璃珠振荡分散
30、，以无菌滤纸或脱脂棉过滤，使形成单细胞，分散程度达90%-95%。要求菌悬液浓度：细菌约1108个/mL，放线菌约107-108个/mL，霉菌约106-107个/mL。,4)紫外线照射，取以上制备好的菌悬液3mL于直径7cm的平底平皿中(直径9cm平皿，约加5-6mL)。紫外灯打开预热20min，以稳定光波。将盛有菌悬液的平皿放到磁力搅拌器上，离灯管一定距离，打开皿盖，暴露紫外光下照射一定时间，边搅拌边照射，力求使细胞均匀吸收紫外线光波。以上照射过程必须在备有黄光或红光的暗室内进行，以免光修复。据国外报道，经过紫外线诱变后的菌体(特别是细菌、放线菌)转入到无菌试管内，并立即浸入冰水中1-2h，
31、在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率。,5)后培养，根据延迟现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增值的培养基中，在适宜温度下培养l.5-2h。有些微生物在增殖培养基中加人适量的酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质，可以抑制修复，有利于突变体繁殖和减少细胞悬液在贮存过程中的死亡，能明显提高突变率。6)稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照皿，培养后，桃取菌落，以待筛选。,1、微波 微波是一种电磁波，其生物学效应分为热效应和非热效应。有人研究了微波诱变大肠杆菌和米曲霉的生物
32、学效应。在辐射过程中采用分散低温干燥法，消除微波热效应的影响。发现微波对微生物有一定的致死能力和诱变效应。选择适当的剂量和样品处理方法，可起到较好的诱变效果。,(三)其他物理诱变剂,2、红外射线 应用红外辐射和紫外辐射对果胶酶产生菌的原生质体和孢子进行诱变，发现红外辐射能促进菌体代谢，提高对紫外损伤的抗性。在紫外线中增加红外辐射可显著提高诱变效果。红外辐射产生的突变株产酶性能显著高于对照亲株，说明红外辐射是有效的微生物物理诱变因子。,3、激光 激光是一种光量子流，又称光微粒。科学家1968年提出小剂量辐射对生物有刺激效应的研究理论后，激光应用于生物学领域的成就备受人们的关注。激光辐射可以通过产
33、生闪、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接地影响生物有机体。引起DNA、染色体畸变效应，酶的激活和钝化以及细胞的分裂和细胞代谢活动的改变等。除紫外波段的激光有诱变作用外，可见光红光波段间的激光也有诱变作用。曾有人用激光照射棉病囊霉引起突变而产生核黄素，对酿酒酵母AS2.1189进行CO2激光诱变育种，发现对酵母菌乙醇代谢的改变有刺激效应。目前激光成为微生物的常用诱变剂。,4、高能电子流 高能电子流是较强的电离辐射线，在抗生素菌种选育中都采用这种诱变剂，普遍接受的诱变剂量为杀菌率90%-99.9%。在林可霉素产生菌林可链霉菌的诱变育种工作中，采用高能电子流诱变时，70%-90%的杀菌率为最
34、佳剂量。用高能电子辐射果胶酶产生菌的原生质体进行诱变，选出变异株，产酶性能显著优于亲株。,5、离子注入 离子注人是20世纪80年代初兴起的一种材料表面处理的高新技术，主要用于金属材料表面的改性。1986年被用于农作物育种，现在逐渐应用于多种农作物。所谓离子注入诱变，就是利用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性状的变异，从而达到育种的目的。离子注人法作为一项新的生物诱变技术而引起国内外学者的极大关注。离子注人和其他常规诱变及化学诱变过程有明显的差异。其他辐射诱变仅仅是利用能量的交换，化学诱变剂也只是分子基团的交换，而离子注入在诱变生物学效应上有着明显的优点：,我国1994年报道了离子注入链霉
35、菌的诱变效应，证明离子注入法的高突变率，获得26.73%的正突变率。1995年又有报道指出，采用N+和C4+注入核糖霉素产生菌、卡那霉素抗性产生菌时，其中以N+的诱变效果最显著。1997年，又有报道N+注入红霉素产生菌的诱变效应，认为离子注入产生的自由基对生物效应基本上无影响。离子注入右旋糖酐产生菌，得到产量提高36.5%的变株。有关离子注入的诱变机制研究工作仍在进行，它是一类高效、方便、安全无污染的新型诱变源，将引起越来越多的育种工作者的重视。,二、化学诱变剂,化学诱变剂是一类能对DNA起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质。化学诱变剂主要包括四大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂以及
36、其他种类等。化学诱变剂的作用机制都是与DNA起化学作用，诱变效应和它们的理化特性有很大关系，使用前必须认真了解和掌握。,这些化合物的稳定性以及影响其稳定性的条件，如温度、光照、pH的影响、化合物的半衰期以及与溶剂或增溶剂是否起反应等,使用化学诱变剂时应注意：绝大多数化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全防止污染环境，造成公害。,化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。在进行化学诱变处理时，控制使用剂量要以诱变效应大、而副反应小为原则。处理时的温度对诱变效应也有一定影响。,（一）碱基类似物,碱基类似物是
37、一类和天然的嘧啶嘌呤等四种碱基分子结构相似的物质，是一种既能诱发正向突变，也能诱发回复突变的诱变剂。用于诱发突变的碱基类似物有5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-溴脱氧尿嘧苷(BUdr)、5-碘尿嘧啶(5-IU)等，它们是胸腺嘧啶的结构类似物；2-氨基嘌呤(AP)、6-疏基嘌呤(6-MP)是腺嘌呤的结构类似物。最常用的碱基类似物是5-BU和AP。,AP,A,G,5-溴尿嘧啶(5-BU)诱变机制,由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因此，处在静止或体眠状态的细胞是不适合的。细菌采用对数期的细胞，霉菌、放线菌采用孢子，但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5
38、-BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。从以上5-BU的互变异构可以看出，它们诱变作用是通过本身分子结构产生酮式烯醇式的变化而实现的。酮式和烯醇式这种互变异构是普遍存在的，在DNA分子中的胸腺嘧啶和鸟嘌呤也同样会发生这种互变异构现象。,2-氨基嘌呤(AP)诱变机制,容易诱发ATGC的转换,（二）烷化剂,烷化剂是诱发突发中一类相当有效的化学诱变剂，这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，它们易取代DNA分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基起烷化反应，从而改变DNA分子结构，引起突变。,单功能烷化剂：亚硝基类、磺酸酯类、硫酸酯类、重氮烷类和乙烯亚胺等功能烷化剂：硫芥子类与氮芥子类等。,烷化剂分单功能烷
39、化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。,前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂(如硫芥、氮芥)的两个烷化基团特异地和DNA鸟嘌呤起反应，很容易在相对DNA链之间形成共价链而产生交联现象，妨碍双链完全分开，影响DNA复制，最后导致生物细胞的死亡。当然双功能烷化剂除了交联反应外，也具有单功能的烷化作用。,1、烷化剂的作用机制,烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化,碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类,胸腺嘧啶O4腺嘌呤N2腺嘌呤N3胞嘧啶N3,通过对鸟嘌呤N7位点的烷化而导致突变有三种可能：烷
40、化嘌呤引起碱基配对错误，脱嘌呤作用，鸟嘌呤的交联作用,烷化剂的诱变机制比较复杂，有的尚未完全弄清，但是碱基转换引起错误配对，是造成基因突变的主要原因。烷化剂的诱变效应也很复杂，它们能够诱发DNA多种突变，且形成各种突变类型。其中某些诱变剂诱变效应很高，称为超级诱变剂，如亚硝基胍等。,烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。因此，化学诱变剂要现用现配。不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用一样，有的分解产物会失去诱变作用或具有毒性。因此，保藏时要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。,一般烷化剂杀菌率低而诱变效应高
41、，如亚硝基类、磺酸酯类等。但烷化剂多数极毒，能致癌，所以无论在配制药品、诱变操作及诱变后器皿处理时，都要小心谨慎，注意安全，避免直接接触身体以及防止污染环境。下面介绍几种常用的烷化剂：,2、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(简称亚硝胍，NTG，NG或NG或MNNG),亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO，颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线菌等微生物时，不经淘汰，就可以直
42、接得到10%以上的营养缺陷型突变株，而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。NTG还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变。,NTG在水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。当溶液pH低于5.5时，NTG分解成HNO2，HNO2自身就具诱变作用；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷(CH2N2)，对核酸起烷化作用，引起微生物突变；当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA起烷化反应而导致突变。通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备菌悬液都要用适宜的缓
43、冲溶液。常用的有磷酸缓冲液和Tris缓冲液。,NTG的诱变处理方法：取新鲜的斜面，用一定pH值的磷酸缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌作成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子(真菌或放线菌)须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，则可用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107/mL；,配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酚胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1(缓冲溶液9mL：NTG丙酮溶液1mL)，一般NTG母液浓度配成lmg/mL。使用时取母液0.2mL，加菌悬液1.8mL，NTG最后处理浓度为100ug/mL。一
44、般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为100-1000ug/mL，而放线菌、真菌孢子为1000-3000ug/mL。,混合保温，将以上菌悬液和NTG溶液盛于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温(细菌30-35、真菌25-28、放线菌30-32)处理若干时间，一般细菌为20-60min，孢子90-120min。,终止反应：用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度，分离于平皿。如果是细菌，把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，把表型稳定的突变细胞培养液进行稀释分离到平皿上。,处理完毕后，马上把接触过N
45、TG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理。,摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加入5-10ug/mLNTG，并加几滴吐温80或吐温60，使成乳化状(注意吐温对该菌生长是否有影响)；,在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板,NTG浓度为l0-50ug/mL。或将琼脂培养基制成平板，然后将NTG和菌体混合涂抹平板，此时NTG浓度为10-20ug/mL。,经过培养的培养液，除部分进行平板分离外，剩余的培养液可以加入适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50%甘油水溶液加入1/3容积(
46、最终浓度为12.5%)于-40、-80保存。在以后数天内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。如果要把培养液直接置冰箱保存，通过试验确定一种适合低温保存的培养基，使它们在保存期间总菌数的死亡率和正突变体的死亡率都降低到最小值。,无论是用辐射线处理，还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或后培养液，浸在冰水浴中2-3h，试验的重复性很好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果。NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1-2mol/L的Na0H或2%的N
47、a2S2O3浸泡过夜，洗净。,3硫酸二乙酯(DES)DES是无色的液体，不溶于水，溶于乙醇，具一定毒性，很不稳定。DES在水溶液中半衰期很短，20时为3.3h，30时为lh，40时仅0.3h。因此，要严格做到随用随配，并且要低温、干燥、避光保存。DES诱变效应同样受酸碱条件的影响，pH中性时效应最好，配制溶液和制备菌悬液都要用0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液。,DES的处理方法：(以处理浓度1%为例)取DES原液0.4mL于灭菌试管中，加入少量乙醇使其溶解，再加进pH7.2的磷酸缓冲液19.6mL，配成体积分数为2%的溶液；用同一种磷酸缓冲液将新鲜斜面的细菌或真菌孢子洗下，制成菌悬液，
48、含菌密度107-108/mL；取以上DES溶液和菌悬液等量(如5:5)加入到无菌试管内混合，最后处理浓度为1%，在一定的温度下，振荡处理20-60min；诱变处理结束加人生理盐水稀释，或加入Na2S2O3 0.5mL终止反应。如果是细菌将20mL肉汤培养基加入到以上菌体沉淀物中，进行1.5-2h后培养，然后稀释、分离于平皿。,移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素(2,8-二氨基吖啶)等化合物。移码诱变剂对噬菌体有较强的诱变作用，尤其是对噬菌体T2、T4；诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某些产生抗生素的放线菌，用吖啶类处
49、理后，发现产量明显下降，主要就是出于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。,（三）移码诱变剂,溴化乙啶（EB）,（1）吖啶化合物的诱变机制 DNA双链上的两个碱基之间插入吖啶类化合物分子，使DNA链拉长，两碱基间距离拉宽。由于这类化合物与DNA结合后，使碱基插入或缺失，在DNA复制时造成点突变以后的所有碱基都往后或往前移动，引起全体三联密码转录、翻译错误而突变，故称这种突变为移码突变。,吖啶类化合物的诱变机制,（2）吖啶黄的性质和使用方法 吖啶黄是淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，遇光易分解，须避光保存。吖啶黄使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的母液。通常处理方法是将它们加入培养基
50、中，使最后浓度为10-50ug/mL，混合后制成平板，将处理菌悬液分离其上，适温培养，在生长过程中处理。另外，还可将吖啶黄加入到培养液中，浓度为10-20ug/mL，在适温条件下，振荡培养过程中处理。,羟胺的分子式为NH2OH(简称HA)，常以盐酸羟胺形式存在(分子式为NH2OHHCl)，为白色晶体，溶于水，不稳定易分解，具腐蚀性，容易吸湿，放要密封、干燥保存。,1、羟化剂羟胺,(四)其它化学诱变剂,（1）羟胺的诱变机制 羟胺是具有特异诱变效应的诱变剂，专一地诱发G：CA：T的转换。对噬菌体、离体DNA专一性更强。DNA分子上和羟胺发生反应的碱基主要是羟化胞嘧啶上的氨基。当羟胺浓度为，pH6.
