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1、基因转移技术,生技30802龚凯,概述,运用物理、化学或生物学的方法和技术将外源基因转移到受体细菌或者细胞内，并使之在细菌或细胞内实现转入基因的扩增好表达称为基因转移技术。它是重组DNA技术和基因治疗的关键步骤之一。,两个概念,转化：质粒DNA或其他载体与目的基因DNA构建的重组载体导入宿主细胞的过程。转染：噬菌体，病毒或以其他作为载体构建的重组载体导入宿主细胞的过程。,基因转移技术的应用,外源基因与载体在体外重组形成重组DNA分子后，为了分析基因的表达，测定表达对细胞生长的影响，研究该基因的结构与功能，得到高表达的基因产物，通常需要将重组DNA分子通过特定的方法导入宿主细菌（细胞）。,基因转
2、移技术的分类：,第一类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从体内取出的细胞，观察目的基因在细胞中的表达，这项技术称基因转染(gene transfection)技术。通常情况下，该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整合，而是在细胞质呈现暂时性表达，随时间推移而逐渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，需用病毒载体将目的基因导入细胞，并发生整合；,第二类是将已克隆的目的基因导入受精卵，并将导入基因后的受精卵植入子宫，发育成胚胎和个体，胚胎期和出生后均可观察目的基因在整体内的表达，此项技术称转基因技术（transgenic technique），转
3、基因技术所产生的动物称转基因动物(transgenic animal)。,1.基因转移的物理学方法2.基因转移的化学方法3.基因转移的生物学方法,第一节、基因转移的物理学方法,主要有:1.显微注射法2.电穿孔法3.基因枪法,一、显微注射法(Microinjection),受体细胞主要是卵细胞，现在也用于贴壁细胞成功率与操作者的熟练程度有关主要用于转基因动物,显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。,它是目前基因转移效率较好的一
4、种基因转移方法，1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；2.外源基因的长度不受限制,可达100kb；3.实验周期相对比较短。,二、电穿孔法(Electroporation),电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等优点。,（1）基本原理,在高压电场的作用下，细胞膜因发生临时性
5、破裂所形成的微孔，足以使大分子以及像ATP这样的小分子从外界进入细胞内部，或是反向流出细胞。细胞膜上微孔的关闭是一种天然衰减的过程，在0下，这种过程会被延缓进行。在微孔开启期间，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。具有游离末端的线性DNA分子，易于发生重组，因而更容易整合到寄主染色体，形成永久性的转化子。超盘旋的DNA比较容易被包装进染色质，因此一般说来它对于瞬时基因表达的实验更为有效。,（2）操作程序,将盛有细胞和 DNA混合液的特制小容器置于电泳冲仪的正负电极之间，在 0 下加高压(2.04.0kV)电脉冲 10分钟后，将处理的细胞转移到新鲜培养基中生长 2天，再行筛
6、选。电穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细胞10小时，可提高转化效率310倍。,(3)影响因素,脉冲的最大电压和脉冲持续的时间，是影响电穿孔转染效率的两个主要因素，而与DNA浓度则无多大关系。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法得到的永久转化的频率约为10-410-5之间。,可用于真核、原核细胞的转染优点：简单、重复性好、转移效率高缺点：对细胞有损伤,三、基因枪法(gene gun),该法又称粒子轰击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojecti
7、on)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment)，是由美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功。,在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功。,基本原理：通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA
8、吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。优点：具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。,第二节、化学转染法,利用化学物质对细胞或DNA分子进行处理和修饰，以使外源性DNA顺利进入细胞内的方法。包括：1.氯化钙转移法 2.DNA-磷酸钙共沉淀法 3.DEAE-葡聚糖转染技术 4.脂质体转染法(liposome),1.氯化钙转移法,感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。目
9、前常见的感受态细胞的制备方法有CaCl2,RbCl2法，RbCl2发制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行。,氯化钙转移法基本操作：,1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时CaCl2会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物。,2.此时，将该体系转移到42下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
10、进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。,3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。,2.DNA-磷酸钙共沉淀法,核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使DNA 附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA 仅有1%5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA 可以与细胞DNA 整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA 导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。,先将
11、DNA分子溶解到氯化钙溶液中，再缓慢滴加含磷酸的HEPES溶液，形成细小的DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。小心地将这些颗粒吸出加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，DNA会被靶细胞吞噬。更换培养基以使外源性基因在靶细胞中表达，再筛选转化阳性的细胞。,优点：方法简单，而且可以进行共转化，即将不含选择标记的DNA放在一起形成混合的共沉淀物，一起导入细胞。缺点：转染效率低，约为10-3-10-6。,影响DNA-磷酸钙共沉淀法效率的因素,影响磷酸钙转染效率的主要因素有：1.DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量。2.共沉淀物与细胞接触的保温时间。3.甘油或DMSO等促进因子作用的持续时 间等。,3.DEAE-
12、葡聚糖转染技术,二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA，实现瞬时的有效表达。基因的瞬时表达:是指在DNA进入细胞后迅速发生的反应，因此可作为一种有用的基因分析系统。DEAE-葡聚糖转染的细胞往往可以获得高水平的表达，利于基因瞬时表达(transient expression)实验。,DEAE-葡聚糖转染主要有两种不同的方式,一种方式是先使病毒的DNA直接同DEAE-葡聚糖混合，形成了DNA/DEAE葡聚糖复合物后，再用来处理受体细胞。另一种是受体细胞先用DEAE-葡聚糖溶
13、液作预处理，然后再用来与转染的DNA接触。在这两种转染方式中，受体细胞在用DNA或DNA/DEAE葡聚糖复合物处理前，都要先用等渗溶液漂洗，除去培养液中的血清成分。,DEAE-葡聚糖转染的可能机理及影响因素,关于DEAE-葡聚糖促使哺乳动物细胞捕获外源DNA的分子机理，迄今仍不十分清楚。一种认为DEAE-葡聚糖同DNA结合成复合物，可以保护DNA免受核酸酶的降解作用；另一种则认为DEAE-葡聚糖可以同细胞膜发生作用，从而使DNA能够容易地穿过细胞表面而进入细胞内部,影响DEAE-葡聚糖的转染效率的主要因素：细胞的数量、DNA的浓度和DEAE-葡聚糖的浓度最为重要。大体说来，按每个直径10cm的
14、培养皿中加入 110ug的转染DNA，并使用每毫升培养基含100400ug DEAE-葡聚糖的溶液，对于绝大多数类型的细胞，都能得到很好的转染效率。由于DEAE-葡聚糖对有些细胞具有毒性，因此用低浓度溶液作短时间的接触反应可能较为合适。,DEAE-葡聚糖转染与DNA-磷酸钙共沉淀法的几点不同：,1.它一般用于克隆基因的瞬时表达，不易形成稳定转化细胞系，因而不适用于细胞的稳定转染。2.由于它对细胞有毒性作用，所以某些细胞系（如BSC-1,CV-1,COS等）用该转染技术时转染效率很高，而其他类型的细胞则效率不满意。3.DEAE-葡聚糖转染所需DNA比DNA-磷酸钙共沉淀法少。4.用该法导入细胞的
15、DNA突变率高于DNA-磷酸钙共沉淀法。,4.脂质体转染法(liposome),脂质体：是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径251000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。,脂质体转染法的作用机制：,阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体 其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进
16、入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。,第一种常用的脂质转染法是，将外源DNA与阳离子型的脂质体混合形成DNA-脂质复合物(DNA-lipid complex)。这种复合物可有效地被受体细胞捕获，实现基因的高频率转移，故这种方法又叫做DNA-脂质复合物转染法。在这个过程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部，而是通过两者之间的静电引力作用结合在一起的。第二种常用的脂质转染法叫做脂质体载体法。它是将外源DNA包装在脂质体的内部，然后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间的融合作用，使外源DNA进入细胞质，尔后再进入细胞核，实现基因的表达(,脂质体转染法示意图,它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞
17、中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。脂质体中磷脂膜的组成和所有脂类的物理性质对转染效率有很大的影响。如：pH敏感与否、脂质体带正电荷与否等。优点：简便、重复性好、对多类细胞有效、包装容量大、安全性高等。,第三节基因转移的生物学方法,反转录病毒载体介导转染法DNA病毒载体介导转染法,反转录病毒,反转录病毒(retrovirus，RV)是一种单链RNA病毒，其病毒颗粒由包膜和核衣壳组成。反转录病毒感染宿主细胞后，脱去蛋白质衣壳，将病毒RNA基因组释放到细胞质中，病毒RNA基因组在反转录酶的作用下被反转录成线性双链DNA分
18、子。双链DNA分子转移至细胞核后，在病毒整合酶作用下被整合到宿主细胞的染色体，作为细胞基因组的一部分复制，建立原病毒状态，使细胞处于一种潜伏感染状态。随着受感染细胞基因组的复制，原病毒DNA转录出全长的RNA，并经过正常的成熟过程形成多种病毒mRNA，剪切产物被翻译形成新的病毒结构蛋白、调节蛋白，它们与全长的病毒基因组RNA结合装配形成新的子代病毒颗粒，最终以出芽的方式离开细胞。,HIV,反转录病毒的结构,反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序列(5LTR和3LTR)，有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列+，同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和env。,反转录病毒的优点：,第
19、一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。第三，反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。,反转录病毒载体,1.需辅助病毒互助的反转录病毒质粒载体2.无需辅助病毒互助的反转录病毒质粒载体,反转录病毒载体的作用机理,反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右，以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂
20、中的细胞。转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的。反转录病毒载体在构建时，删去了pol、env基因和gag基因的3端，但保留了病毒颗粒所需的+序列。其目的是在于提高载体的安全性，防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样，在制备反转录病毒载体时，就必须有一个辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用的外壳蛋白，但自身没有包装信号。这样，反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。,DNA病毒载体介导转染法,1.腺病毒载体2.腺病毒相关病毒载体3.疱疹病毒载体4.嵌合（杂合）病毒
21、载体,第四节 报告基因,报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。,报告基因的特征,作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。,报告基因的应用,在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以
22、下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(npt)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。,nos、ocs,nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。,npt、cat及庆大霉素转移酶基因,npt、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相
23、关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。,-D-葡萄糖苷酶基因,目前常用的一种报告基因是-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。,荧光酶基因(luc),荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门
24、仪器进行检测。,首先向狗胚胎成纤维细胞中植入一种荧光酶基因，这种基因可编码产生红色荧光蛋白质。然后他们采用“体细胞克隆”技术，将转基因处理过的狗胚胎成纤维细胞的细胞核植入剔除了细胞核的卵细胞中，经过发育最终诞生了转基因的克隆狗。,转基因荧光狗,在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、-半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。,cat基因和荧光酶基因,cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高301000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。,
