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1、,实验四 离心技术及物质代谢实验,离心技术,概念：根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。应用：分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。,基本原理,F：粒子在离心场中所受的离心力 a：粒子旋转的加速度 m：沉降粒子的有效质量：粒子旋转的角速度 r：粒子的旋转半径(cm),，,离心力,F=,RCF(relativecentrifugalforce)：相对离心力 rpm(revolutions per minute)：每分钟转速 低速离心时常以转速“rpm”来表示 高速离心时则以“g”表示,相对离心力 离心力相对于重力的
2、倍数，单位是g,沉降系数（S）:超速离心时，颗粒在离心场中的沉降速度用沉降系数来表示，即物质在单位离心力场下的沉降速度。单位：Svedberg，1S=10-13s 是是物质特有的物理常数，可间接反应分子量的大小。离心分离技术的基本理论数据，与物质的大小、形状、密度及介质的密度、粘度都有关，通过对离心力和离心介质的选择，即可分离纯化出不同质量大小和物理形状的物质。,另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生物的核蛋白体RNA（rRNA）分为5S、16S、23S，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。,离心机的类型
3、和主要构造,类型 工业用离心机离心机 制备性离心机 实验用离心机 分析性离心机,普通离心机：6000rpm 高速离心机：600020000rpm 超速离心机：20000rpm,制备性离心机,主要构造 转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系 统，制动装置，指示表盘,转头,1角式转头,2荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。3区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。4垂直转头：其离心管是垂直放置的。5连续流动转头：转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。最大额定转速 一定的使用限度，使用一定次数或一 定时间后递减10%
4、。,离心管,不锈钢和塑料离心管，管帽防止样品溢出。,离心操作的注意事项,使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。,装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。若要在
5、低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。离心过程中不得随意离开,物质代谢实验,实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定血清胆固醇测定血清甘油三酯测定实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量,实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定,【实验目的】检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。【实验原理】,糖酵解的反应过程见下图：,将酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的介质中（适宜的pH，必要的金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，进一步变化是在3磷酸甘油醛脱氢酶催化下进行的，SH为3磷酸甘油醛脱氢酶的必需基团，加
6、入一碘醋酸可与此酶的SH起反应，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。酶-SH+ICH2COOH酶S-CH2COOH+HI,然后以硫酸肼为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸丙糖在反应体系中堆积，从而与2，4二硝基苯肼反应生成相应的苯腙，后者在碱性溶液中溶解呈紫红色，可借此鉴定丙糖之生成。,【实验方法】取试管3支，编号，按下表进行操作记录三管所发生的情况，并加以简要的分析CCL3COOH的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。一碘醋酸的作用：使3磷酸甘油醛脱氢酶失活。硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。,实验注意事项：成腙反应前，溶液必须先碱化
7、并在室温放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定；一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂，使用移液管后必须彻底清洗移液管，否则易导致实验失败。,血清胆固醇测定（酶法）,【实验目的】1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。,血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE,70%)和游离型胆固醇(FC,30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固
8、醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：,【实验原理】,1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。2.取试管3支，编号，按下表操作。,【实验方法】,【计算】A标本 CHO（mmol/L）=标准液浓度 A标准【标准液】胆固醇 5.17mmol/L（200mg/dL）【正常参考范围】3.105.70mmol/L,混匀后，37水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。,血清甘油三酯的测定（酶法）,【实验目的】1、了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。2、掌握酶法定量测定血
9、清甘油三酯的实验方法。,血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式如下：甘油三酯+4H2O 脂蛋白脂酶 甘油+脂肪酸 甘油+ATP 甘油激酶/Mg2+甘油-3-磷酸+ADP 甘油-3-磷酸+O2 甘油-3-磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮+H2O2 2H2O2+ESPAS+4-氨基
10、安替比林 过氧化物酶 红色醌亚胺色素+4H2O,【实验原理】,1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。2.取试管3支，编号，按下表操作。,【实验方法】,【计算】A标本甘油三酯（mmol/L）=标准液浓度 A标准【标准液】甘油三酯 2.26 mmol/L【正常参考范围】0.561.71mmol/L,混匀后，37水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。,葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水 浴加热至100左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅并进行630nm波长比色测定其含量。,实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量,【实验目的】,掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法,【实验原理】,1）取试管四支，按下表操作,【实验方法】,2）混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却3）用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值,4)计算,【标准液】葡萄糖标准液 0.1 mg/ml【正常参考范围】3.96.1mmol/L,
