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1、生物技术综合实验,2010.3,实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定,实验目的,学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法；学习提取生物活性大分子的方法。,实验材料,材料：活性干酵母粉、石英砂；试剂：95冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、5蔗糖溶液、1N NaOH溶液；仪器：水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光 光度计。,实验原理,蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法；蛋白质等生物活性大分子的提取方法。,提取工艺和酶活测定,蔗糖酶蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在pH3.08.0范围内均可保持较高的酶活；蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂（如Vc）
2、保持酶活力；酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后者活力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。,提取工艺1.破碎酵母细胞的方法：蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活；或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染；原则：低温，处理时间短，防止酶失活。,2.选择性热变性：根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去，而蔗
3、糖酶保持活性仍在上清液中；该法简便易行。原则：1、选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性，2、溶液的蛋白质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。3.有机溶剂沉淀法：根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的 物沉淀的条件。原则：1、注意在低温下操作，故无水乙醇要预冷；2、边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活；3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。,测定酶活的原理蔗糖酶可作用于1，2糖苷键，将
4、蔗糖水解为D葡萄糖和D果糖；Cu2+、Zn2+、Fe2+是其激活剂，Mn2+是其抑制剂。葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。,提取酶注意事项了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择合适的提取条件；提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）；提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素；一般先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法（如离子交换层析、亲和层析
5、、超滤）精制；通过酶活测定，调节提取条件。,实验步骤,反复冻融法破碎酵母细胞 称取0.5g活性干酵母粉，0.2g石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状，加入10mLPBS（pH7.2），混合均匀，研磨5min,20度冷冻（液面结一层薄冰即 可），再研磨5min；离心获得粗酶液 吸取3mL酵母细胞破碎液于离心管中（两组同学配平），5000rpm 15min，保留上清液；粗酶液分离纯化获得纯酶液吸取剩余的7mL酵母细胞破碎液于烧杯中，45度水浴15min，缓慢搅拌（防止产生泡沫，蛋白质变性），迅速冷却，5000rpm 15min，保留上清液；选择性热变性除去杂蛋白将上清液置于烧杯中，加入等体积预冷的
6、无水乙醇（乙醇终浓度约50），边加边缓慢搅拌，20度静置1520min，5000rpm 15min，保留沉淀物；有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶吸取7mLPBS（pH7.2）于沉淀物中，轻轻搅拌促溶；纯酶液,酶活测定蔗糖酶将底物水解为还原糖,2、DNS法测定还原糖量,实验结果,计算酶活力 将吸光值代入葡萄糖标准曲线，得到1.0mL水解液中还原糖量（m）酶活力（U/mL）m（mg）3.5（水解液总体积）/1.0（吸取酶液体积）蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量为一活力单位。葡萄糖量标准曲线的回归方程为：y=0.6746x+0.02736 y：吸光值 x：还原糖量,思考题,简述影响蔗糖酶得率的因素。,
