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1、技术路线,双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：,明场下对脊髓定位，利用双光子强激光对脊髓进行深度扫描切割损伤,12小时后做纵切切片，利用生物胞素抗体做免疫染色,判断损伤的位置与大小是否与符合,前期实验：,手术建模：手术组（n=68）假手术组（n=68）,建模成功性分析：每周分析术后运动能力，连续跟踪7周,基因芯片分析：提总RNA分析全部基因的表达水平，统计分析各个基因表达变化,定量PCR：提总RNA反转录检测sema4e和plxnd1 相对内参GADPH表达水平的变化,原位杂交：制作切片制作探针检测sema4e和plxnd1 mRNA的表达水平变化及表达细胞,Westen Bolt：提总蛋
2、白检测sema4e和plxnd1蛋白表达水平的变化,取脊髓（损伤位点以下1cm）：术后4hour,12hour,6day,11day组,sema4e与plxnd1关系研究：,sema4e活性片段DNA的扩增,sema4e特异性肽段的设计与合成,sema4e表达载体的构建,表达载体的导入,转染细胞的筛选与培养,表达蛋白的提取,表达蛋白的活性检测,sema4e免疫磁珠的制作,sema4e与plxnd1免疫共沉淀,噬菌体展示技术淘选抗体,ELISA检测抗体活性,ELISA检测抗体专一性,sema4e与plxnd1免疫共定位,sema4e与plxnd1在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：,前期结果,Be
3、fore lesion,Red:sham operation(n=10)Blue:operation(n=10),图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化,Real time PCR,time points,change folds,10X,10X,10X,10X,10X,anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day,10X,10X,10X,anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day,sema4e:,plxnd1:,10X,10X,通过双光子显微镜活体观察斑马鱼脊髓内的血管,plxnd1 在血管内皮细胞上表达,10X,20X,
