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1、世界濒危野生麋鹿外周血TNF超家族相关基因的克隆、表达及序列分析,报告人：闵翠指导老师：张双全教授 陈玉清副教授专业：生物化学与分子生物学,开题报告,1.前言,2.研究现状及立题依据和意义,3.拟采取的方法和技术路线,5.已有成果,4.进度安排,前言,麋鹿TNF超家族,【分类地位】,界：动物界 Animalia门：脊索动物门 Chordata纲：哺乳纲 Mammalia目：偶蹄目 Artiodactyla科：鹿科 Cervidae亚科：鹿亚科 Cervinae属：麋鹿属 Elaphurus，Milne-Edwards，1866种：麋鹿 E.Dravidians,麋鹿,【中文名称】：麋鹿【拉丁学
2、名】：Elaphurus davidianus【俗名】：四不像【国家重点保护动物级别】：一级【世界自然保护联盟(IUCN)】：濒危【生态环境】：低洼湿地和沼泽（大丰麋鹿自然保护区）【致危因素】：栖息地破坏，过度捕猎【国内分布】：北京，江苏(人工引进)，湖北（天鹅洲麋鹿自然保护区）,肿瘤坏死因子超家族,肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族成员是TNFR超家族成员的配体，都是II型跨膜蛋白，并且在C端胞膜外区有一段约150aa的同源序列。,二 研究现状及立题依据和意义,（一）国内外对麋鹿的相关研究麋鹿自然栖息环境，生态模式的研究麋鹿的形态生理、生长繁殖，引种，进
3、化的研究麋鹿的保护及人工圈养，半散养及野生放养的研究麋鹿的保护机制及方法的研究,（二）TNF超家族的相关研究1.目前，在国内外对哺乳动物人、鼠，牛，羊的 TNF家族的许多基因已被克隆及表达。近几年，本实验室通过同源克隆和 RACE 技术分别克隆出了猪、鸭、鹅、兔和鸽子的 BAFF，APRIL，TWEAK等TNF家族的相关基因，并均已在 GenBank 数据库中申请了登陆号。,2.目前对于TNF家族生物活性的研究主要有以下几个方面（1）杀伤或抑制肿瘤细胞（2）提高中性粒细胞的吞噬能力（3）抗感染（4）诱导肝细胞急性期蛋白的合成的研究（5）促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化（6）促进细胞增殖和分化,
4、立题依据,1.关于人和其他动物如鼠，牛，羊的 TNF家族的基因（BAFF,APRIL,TWEAK,TRAIL等）的理论研究及其应用进展为本课题的立题及开展奠定理论基础。2.麋鹿是国家一级重点保护动物，属于濒临灭绝的物种，但国内外关于麋鹿的分子基因层面研究甚至是鹿科动物的研究都处于空白状态。3.本实验室几年来取得的关于人和哺乳类，禽类BAFF，APRIL,TWEAK等TNF超家族基因的一系列研究进展为本课题的顺利开展和完成搭建了一定的平台。,立题的意义,1.本实验弥补对于国家一级保护动物麋鹿分子基因层面研究的空白，提高对于野生麋鹿资源的保护。2.对于麋鹿TNF超家族基因成员的研究为解决麋鹿的各种
5、免疫性相关的疾病及免疫防御机制提供相关的依据，从而起到保护野生资源的目的。3.对于麋鹿TNF超家族相关基因的研究为研究免疫基因的进化提供依据。,三 拟采取的研究方法和技术路线,选取实验材料（江苏大丰野生麋鹿自然保护区）,野外采血,血液总RNA的提取,逆转录得到cDNA,兼并引物,BAFF，APRIL基因,原核表达PET43.1,真核表达酵母,蛋白,蛋白结构作用研究，活性分析,TNF-,TWEAK,TRAIL等,序列分析，免疫进化,引物设计,四、进度安排,研究生一年级上学期：专业课的理论学习；研究生一年级下学期：阅读大量的专业文献，并做一些预期实验；研究生二年级上学期：完成麋鹿相关基因 的克隆,
6、并完成APRIL的表达，功能研究的工作；研究生二年级下学期：对已经克隆得出的基因进行表达，并完成文章一篇；研究生三年级上学期：对完成真核、原核表达已获得的基因的胞外可溶区片段研究，并对其功能与结构进行初步研究，完成文章一篇；研究生三年级下学期：撰写毕业论文，准备答辩。,五、已取得成果,750bp,图一：APRIL基因的CDS区琼脂糖凝胶电泳图,450bp,图二：APRIL基因胞外可溶性片段琼脂糖凝胶电泳图,1 ATGCCAGCCTCATCTCCTTCCTTCCTAAGCCCCAAAGGGCCCCAGGGAGACATGGGGGGA 601 M P A S S P S F L S P K G P
7、Q G D M G G 2061 CCCGTCCGAGAGCCAGCACTCTCAGTTGCCCTCTGGTTGAGTTGGGGGGCGGCTCTGGGG 12021 P V R E P A L S V A L W L S W G A A L G 40121 GCTGTGGCTTGTGCCATGGTTCTGCTGACCCAACAAACCGAGCTGCAGACCTTAAGGAGA 18041 A V A C A M V L L T Q Q T E L Q T L R R 60181 GAGGTGAGCCGGCTGCAGAGGAACGGAGGGCCCTCCGAGAAGCGGGAAGGGAATCCA
8、TGG 24061 E V S R L Q R N G G P S E K R E G N P W 80241 CTGAATCTCCAGGAGCAGAGCCCTGATGGCACAGTAGGCCGGGAGAATGGGGAGAGATCC 30081 L N L Q E Q S P D G T V G R E N G E R S 100301 CGGAGAAGGAGAGCAGTGCTCACCCGTAAACAGAAGAAGAAGCGCTCAGTTCTGCATCTT 360101 R R R R A V L T R K Q K K K R S V L H L 120361 GTTCCCATTAACATC
9、ACCTCCAAGGAGGACTCTGATGTGACAGAGGTGATGTGGCAACCA 420121 V P I N I T S K E D S D V T E V M W Q P 140421 GCTCTCCAGCATGGGCGAGGCTTGGAGGCCCAAGGATATGTTGTTCGAGTCTGGGATGCT 480141 A L Q H G R G L E A Q G Y V V R V W D A 160481 GGAGTTTATCTGCTGTACAGCCAGGTCCTGTTTCATGATGAGACTTTCACCATGGGTCAG 540161 G V Y L L Y S Q V
10、 L F H D E T F T M G Q 160541 ATGGTATCTCGGGAGGGACAAGGAAGGCAAGAGACTCTATTCCGATGCATACAAAGCATG 601181 M V S R E G Q G R Q E T L F R C I Q S M 200601 CCCTCCAACCCTGACTGGGCCTACAACAGCTGCTACAGTGCAGGTATCTTCCATTTACAC 660201 P S N P D W A Y N S C Y S A G I F H L H 220661 CACGGGGATATCTTGAGTGTTATAATCCCTCGGGCAAGGGCCAAACTTAGCCTCTCTCCA 720221 H G D I L S V I I P R A R A K L S L S P 240721 CATGGAACCTTCCTGGGGTTTGTGAAACTGTGA 753241 H G T F L G F V K L*250,图三：麋鹿APRIL的核苷酸序列及推演出的氨基酸序列图,图四：通过clustalw软件比对麋鹿，羊，牛，猪，狗，兔子，人的APRIL氨基酸序列图,80KD,图五：nus-his-麋鹿可溶性April融合蛋白表达图,谢谢！敬请老师同学们指导！,
