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1、志贺氏菌检测技术,河北省疾病预防控制中心 甄素娟,志贺氏菌是引起人类细菌性痢疾的病原菌，仅引起人类的肠道内感染，对其他动物均无致病力，可随患者的粪便污染外环境。细菌性痢疾至今仍然是我国城乡最为常见的肠道传染病,病人和带菌者是本病的传染源，尤以非典型病例、慢性患者和带菌者在流行病学上的意义更为重要。,主要内容,生物学性状标本采集和运送分离培养初步鉴定血清凝集系统生化鉴定,生物学性状,形态与染色 为革兰氏阴性杆菌，长约2-3 m,宽0.5-0.7 m。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。,培养特性,需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为。37培养18-24小
2、时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。,生化特性,能分解葡萄糖，产酸不产气（福氏6型和鲍氏13、14型的部分菌株会产生少量气体）。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，氧化酶、VP试验均阴性，不产生H2S和尿素酶。根据生化反应可进行初步分类。,常以甘露醇和乳糖发酵特性来区分志贺菌的生化群,常以甘露醇和乳糖发酵特性来区分志贺菌的生化群,A群：痢疾志贺菌，甘露醇、乳糖、棉子糖及鸟氨 酸脱羧酶均阴性。B群：福氏志贺菌，棉子糖和甘露醇阳性（其
3、 中4、6型常见甘露醇阴性的变种），乳糖及鸟氨酸 脱羧酶阴性。C群：鲍氏志贺菌，甘露醇阳性，乳糖、棉子糖及 鸟氨酸脱羧酶（除13型）均阴性。D群：宋内氏菌，甘露醇和乳糖（迟缓）阳性，鸟 氨酸脱羧酶阳性。,志贺菌属抗原分类,标本采集,粪便标本 应尽量在抗生素应用前采集，采集新鲜粪便标本中的脓血、黏液部分1g5g（水样便1ml5ml）。肛拭子或采便管将标本立即保存于Cary-Blair运送培养基内送检,水标本直接增菌法:直接采集可疑水样450ml，加入50ml 10倍浓缩的GN增菌肉汤，37增菌68h。过滤集菌法：采集水样5001000ml用无菌滤膜（0.450.65m）过滤，取下菌膜直接贴种于选
4、择性平板培养过夜或无菌条件下剪碎后放入9mlGN增菌肉汤，37增菌68h后转种平板。吸附沉淀法,食品固体：于广口瓶或无菌塑料袋中，实验室无菌称取25g样品，剪碎后加入225ml GN增菌肉汤中，37增菌68h。液体：采取食品50100ml，实验室无菌称（量）取25g（ml）样品加入225ml GN增菌肉汤中，37增菌68h。乳粉类应以无菌操作取25g放入装有225ml灭菌盐水的三角瓶中，摇匀，37增菌68h。,血液:当怀疑为菌血症时，静脉采集510ml血液，按1:10比例加入血增菌培养液中进行培养。,其他标本:疑似痢疾爆发疫情病原学检测时外环境样本可采集患者的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、
5、污水、井水等，采集的标本应立即按1：10的比例接种GN增菌肉汤，置37增菌68h。媒介昆虫如苍蝇类，用消毒蝇拍拍打1015只/份,装入9mlGN增菌肉汤中，尽快送实验室，置37增菌46h。,标本运送,现场采集的粪便标本若在2小时内不能送达实验室，应置冷藏包中送检（内置冰排，可保存13天）。水、食品等外环境标本若在2小时内不能送达实验室，应保存于带有冰排的采样箱内送检。,分离培养,直接分离 采用接种环多点蘸取粪便标本中可疑部分或用采样拭子直接涂种，接种于麦康凯（MAC）及海克顿（HE）肠道琼脂平板各一块。也可选XLD、SS、DHL或DCA，但应慎用SS琼脂，其可抑制型志贺菌生长。分离平板置37培
6、养1824h。,增菌分离 水、食品及其他标本于GN增菌肉汤中37增菌68h后，直接划线分离MAC及HE琼脂平板各一块，37培养1824h。,在HE上为透明、白色或浅绿色菌落。在MAC上为无色（乳糖阴性），圆形，半透明，湿润、光滑、突起，大小为12mm的菌落。,志贺氏菌在不同平板上的菌落形态,初步生化反应,从37培养1624h的分离培养基上，观察挑选可疑菌落，接种TSI或KAI培养基，先穿刺后划线，做好标记，取出后直接接种动力-靛基质-尿素（MIU）培养基，放37培养16h以上，观察结果。,志贺菌属在TSI上的生化反应为：斜面红色，底层产酸黄色，不产气。在KAI上斜面红色，底层产酸黄色，不产气或有少量气体，不产生H2S。MIU：无动力、尿素酶阴性、靛基质阴性或阳性。,下列培养物可排除志贺菌：KIA斜面和底部均呈黄色或红色有动力者产硫化氢者尿素酶阳性者产生气体者（福氏志贺菌6型有时产少量气体）在1848小时发酵乳糖的培养物（宋内菌35天迟缓分解乳糖）,血清分型,系统生化鉴定,谢 谢,
