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1、实验1 大肠杆菌的培养与分离,第一部分:微生物的应用,细菌的革兰氏染色(P23),革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。,大肠杆菌属于革兰氏阴性菌,异养兼性厌氧菌,细菌的外形与大小,大肠杆菌属于杆状菌,二、培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，
2、可分为天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,液体培养基：扩大培养固体培养基：分离、纯化,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压的要求,细菌喜荤，霉菌喜素细菌中性偏碱，霉菌中性偏酸,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功
3、地培养微生物的关键。,（）消毒定义：,三.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,3.常用的消毒与灭菌的方法,是指利用化学或物理方法，杀灭大部分病原微生物的方法。,是指利用化学或物理方法，杀灭或清除环境中 一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法,高压蒸汽灭菌灼烧灭菌干热灭菌,灭菌方法：,煮沸消毒法 巴氏消毒法(70-75，保温30分钟)化学药剂消毒法（酒精、氯气等）紫外线消毒法,消毒方法：,培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具,需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿,接种环等金属器具,高压蒸汽灭菌锅1kg/cm2、121下维持15min.,三、消毒和灭菌,彻底杀死,部分杀死,1、灼烧灭菌,
4、1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶（3）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,思考,实验用具,LB固体培养基大肠杆菌菌液（LB液体培养基）培养皿接种环酒精棉酒精灯镊子、火柴、记号笔,二、大肠杆菌的培养和分离实验操作,（一）培养基的配制与灭菌,取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口
5、膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。,LB液体培养基细菌的扩大培养LB固体培养基细菌的划线分离,封口膜：既通气又不使菌进入,（二）倒平板,灭菌后的培养基在无菌操作台上，酒精灯火焰附近，倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面,倒平板技术,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,60,注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要
6、使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；若培养皿中已形成菌落，很难再形成单菌落，达不到分离目的。,1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面
7、的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（三）大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37摇床培养12小时。,注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.,（四）大肠杆菌的分离,分离方法:划线分离法和涂布分离法,1、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线.,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法
8、形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,（四）大肠杆菌的划线分离,注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养1224h,1、划线分离法,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的
9、增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一,2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀
10、释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。,（五）大肠杆菌分离后保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,1.在培养后如何判断是否有杂菌污染?,（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和 进一步的形
11、态观察，如用革兰氏染色法等。,2.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,3.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?,转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。,（一）培养基的制作是否合格 将未接种（空白）的培养基放在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌
12、落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,例1下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,答案：B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭
13、菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,：回答有关“大肠杆菌的培养和分离”的问题：（1）大肠杆菌的扩大培养需要用LB培养基50ml，其配方为：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、氯化钠0.5g、水50ml。培养基中加入一定量的氯化钠，目的是。（2）在制备培养基时，有时还需要调节酸碱度，这一步骤应该在灭菌。（填“前”或“后”）（3）用划线法在LB固体培养基上分离大肠杆菌，当接种完成后，盖好培养皿盖，将培养皿，放在37恒温箱中1214h，当看到划线末端出现 时，表明细菌已被分离。（4）如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？,分离时用含相应抗生素的培养基,
14、前,维持一定的渗透压,倒置,不连续的单个菌落,例、（1）在细菌的培养分离过程中涉及多个温度指标，请把下列操作过程和它对应的温度指标用选在每个灭菌过程后面。A.121 B.5060 C.3537 D.2528 E.140 用烘干机干热灭菌23h。恒温培养细菌1824h。恒温培养真菌1824h。溶解或灭菌后的培养基倒平板时的温度。高压蒸汽灭菌。,A,E,C,D,B,（2）在细菌培养的灭菌环节中，对待不同的设备装置用不同的灭菌方法。请在各对象后面选上灭菌方法。A.酒精擦拭 B.火焰灼烧 C.高压蒸汽灭菌 D.G6玻璃砂漏斗过滤 手。接种环。含NaHCO3的培养基。制备无菌水。（3）某同学在将G6玻璃
15、砂包扎后进行了高压蒸汽灭菌，然后取出烘干。烘干后在实验桌上对其刚配置的培养基进行过滤，请问该同学的操作是否满足无菌操作的要求？。,不满足无菌操作要求,A,B,D,C,例3、2005年诺贝尔生理学或医学奖授予两位澳大利亚的医生马歇尔和沃伦，以表彰他们发现幽门螺杆菌及其在胃炎等病中所起的作用（1）1974年沃伦在一份胃粘膜活体标本中发现无数的细菌紧贴着胃粘膜上皮，这种细菌 就是幽门螺杆菌，胃粘膜上皮细胞与细菌细胞结构相比主要区别。,有成形的细胞核，无细胞壁,（2）不同微生物有各自得代谢特点，人们常据此分离鉴别微生物的种类。实验室有两个菌种：胱氨酸倚赖型细菌（无胱氨酸不能生长），甲基营养细胞（只能利
16、用甲醇甲烷作碳源），但试管上标签脱落。某同学的鉴别思路是配制3个培养基，只接种其中的任一菌种，根据生长状况将其鉴别出来，另一种自然鉴别出来。请根据这一思路完成实验方案。实验步骤：第一步：在两个菌种的试管上分别标记AB第二步：不含有胱氨酸和甲基营养物的培养基，分别倒入3个培养皿中，标上123，第三步：,将A菌（或B菌）接种于123号培养皿中，适宜条件下培养数天，观察细菌生长状况,在1号培养皿中加入适量胱氨酸：在2号培养皿中加入等量甲基营养物；3号作为对照，一起灭菌,结果分析：,：若接种的A菌在1号培养皿中能生长，在23号培养皿中不能生长，则A菌为胱氨酸依赖型细菌，B菌为甲基营养细菌；若接种的A菌在2号培养基上能生长，在13号培养基中不能生长，则A菌为甲基营养细菌B菌为胱氨酸依赖型细菌,高压蒸汽灭菌器：1Kg/cm2，121温度下维持15min。应用此法灭菌，一定要充分排除灭菌器内原有的冷空气。用于普通培养基、生理盐水、耐热药品、手术敷料等。,手提式高压蒸汽灭菌器,高压蒸汽灭菌法,
