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1、补充材料,细胞膜细胞融合单克隆抗体技术,细胞膜,细胞膜(cell membrane)是细胞膜结构的总称。有时特指细胞质膜。细胞质膜(plasma membrane)是指包围在细胞表面的一层极薄的膜，主要由膜脂和膜蛋白组成。质膜的基本作用是维护细胞内微环境的相对稳定，并参与同外界环境进行物质交换、能量和信息传递。在细胞的生存、生长、分裂、分化中起重要作用。生物膜(biomembrane):细胞所有膜结构的统称，包括细胞内膜和质膜。,红细胞膜结构,红细胞(red blood cell,erythrocyte)是结构最简单的细胞，也是研究膜结构的最好材料。,红细胞的生物学形态结构：成熟的红细胞呈双面
2、凹或单面凹陷的盘状，直径约为7m,厚度1.7m,表面积为145m2；表面积与体积的比值较大，有得于细胞变形、气体交换和携带。,红细胞的功能红细胞的主要功能是携带O2和运输CO2红细胞血影,红细胞膜三维模型图,肌动蛋白,带3蛋白,血型糖蛋白,血影蛋白,锚蛋白,膜的化学组成,膜的化学组成：脂/蛋白质/糖膜中蛋白质与脂的比例，依据膜的类型(质膜、内质网膜)、细胞类型(肌细胞、肝细胞)、生物类型(动物、植物和原核生物)的不同而不同。蛋白质/脂：与膜的功能密切相关，线粒体 红细胞,膜 脂,生物膜上的脂类统称为膜脂，其分子排列呈连续的双层，构成了生物膜的基本骨架。所有的膜脂都具有两亲性：一个亲水末端(极性
3、端)和一具疏水端(非极性端)。膜脂的主要类型磷脂、鞘脂、胆固醇,磷脂分子的疏水端是两条长短不一的烃链,称为尾部,一般含有1424个偶数碳原子；其中一烃链常含有一个或数个双键,双键的存在造成这条不饱和链有一定角度的扭转。,动、植物细胞膜上都有磷脂,约占膜脂的50%以上；磷脂分子的亲水端是磷酸基团，称为头部；,膜蛋白(membrane protein),膜蛋白分类内在（整合）膜蛋白(intrinsic/integral membrane proteins)：水不溶性蛋白，形成跨膜螺旋，与膜结合紧密,需用去垢剂使膜崩解后才可分离。外在(外周)膜蛋白(extrinsic/peripheral memb
4、rane proteins)：水溶性蛋白,靠离子键或其它弱键与膜内表面的蛋白质分子或脂分子极性头部非共价结合，易分离。脂质锚定蛋白（lipid-anchored proteins)：通过磷脂或脂肪酸锚定，共价结合。,膜蛋白的功能,钠钾ATP酶的功能研究,如何识别含有钠钾ATP酶的脂质体？,流动镶嵌模型(Fluid mosaic model)Fluid-mosaic model was proposed in 1972 by S.Jonathan Singer and Garth Nicolson;蛋白质是以折叠的球形镶嵌在脂双层中；膜具有一定的流动性，不再是封闭的板块结构，以适应细胞的各种功能
5、的需要。,冰冻蚀刻技术揭示的膜结构,膜的不对称性细胞质膜的不对称性是指细胞质膜脂双层中各种成分不是均匀分布的，包括种类和数量的不均匀。膜脂的不对称性膜蛋白的不对称膜糖的不对称,膜脂的不对称分布,膜蛋白的分布不对称：在膜两侧分布不对称，如：红细胞的血型糖蛋白分子伸向膜内、外侧面的氨基酸残基的数目不对称。血影蛋白分布在红细胞膜的内侧面。一般说,细胞质面的蛋白比外表面少,一些酶和受体多处于外表面,如：5-核苷酸酶、磷酸脂酶、Mg2+-ATP酶、激素受体、生长因子受体位于外表面；腺苷酸环化酶则处于膜的内表面。,膜糖分布的不对称性,The biological role of asymmetry膜脂、膜
6、蛋白及膜糖分布的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向性,保证了生命活动的高度有序性。膜不仅内外两侧的功能不同,不同区域的功能也不相同。造成这种功能上的差异,主要是膜蛋白、膜脂和膜糖分布不对称引起的。细胞间的识别、运动、物质运输、信号传递等都具有方向性。这些方向性的维持就靠分布不对称的膜蛋白、膜脂和膜糖来提供。,膜的流动性膜的流动性是指构成膜的脂和蛋白质分子的运动性。膜的流动性不仅是膜的基本特性之一，也是细胞进行生命活动的必要条件。膜的流动性的生理意义细胞质膜适宜的流动性是生物膜正常功能的必要条件。酶活性与流动性有极大的关系，流动性大活性高。如果没有膜的流动性，细胞外的营养物质无法进入，细胞内合
7、成的胞外物质及细胞废物也不能运到细胞外，这样细胞就要停止新陈代谢而死亡。膜流动性与信息传递有着极大的关系。如果没有流动性，能量转换是不可能的。膜的流动性与发育和衰老过程都有相当大的关系。,流动性的表现形式膜脂的运动方式(脂的流动是造成膜流动性的主要因素)侧向扩散(lateral diffusion)旋转运动(rotation)翻转扩散(transverse diffusion),膜蛋白的运动,随机移动定向移动局部扩散,膜流动性的研究方法,人、鼠细胞融合实验1970年，L.David Frye 和Michael Edidin 进行了人、鼠细胞融合实验，令人信服地证明了膜蛋白的流动。,光脱色荧光恢
8、复技术(fluorescence recovery after photobleaching FRAP)这种方法不仅能够证明膜的流动性，同时也能测量膜蛋白扩散的速率。,磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）,Imaging apoptotic response in vivo,Vasilis Ntziachristos,et al.Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin VCy5.5 conjugate,PNAS,2004,101(
9、33):1229412299.,细胞质膜的功能,细胞膜的功能,界膜和区室化调节运输：膜对物质的运输具有选择性功能定位与组织化信号的检测与传递参与细胞间的相互作用能量转换,细胞融合与单克隆抗体,细胞融合概述,细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。,一、细胞融合的定义,Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的
10、血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。,二、细胞融合研究进展,几种细胞融合成功的例子,植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合
11、的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,三、动植物细胞的融合过程,四、细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,细胞融合的基本原理,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解,细胞融合的常用方法,仙台病
12、毒法,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚；在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需 要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；融合成巨大细胞，仍需ATP。,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程
13、示意图,优点是易得，用法简单，融合效果稳定。聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50PEG溶液。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。,二、聚乙二醇（PEG）法,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的
14、水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤（1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀；（2）离心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每
15、个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。（6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。,电融合法,电融合诱导法原理示意图,电融合的基本过程：细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接
16、触的细胞融合在一起。,电融合法的优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察 融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,应用-杂种细胞的筛选,根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：异核细胞：非同源细胞的融合体。同核细胞：两个相同细胞的融合体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选,常用的杂种细胞筛选方法,单克隆抗体技术,免疫球蛋白（抗体）,免疫球蛋白的结构,免疫球蛋白的
17、功能：,1.结合抗原与中和作用 2.激活补体 3.结合细胞 介导 I 型超敏反应 调理吞噬作用 ADCC作用4.通过胎盘和粘膜（IgG 和 IgA）,五类免疫球蛋白的特点和功能,五类免疫球蛋白的结构：,五类免疫球蛋白的特性与功能：,IgG:IgM:,血清中含量最高，再次应答的主要抗体与SPA结合 抗感染的主要抗体通过胎盘,五聚体 最早出现的 Ig 近期感染的指标 m IgM是BCR无铰链区,五类免疫球蛋白的特性与功能：,IgA:IgD:,分泌性和血清型 初乳中含sIgA 黏膜免疫sIgA为二聚体,IgE:含量最少介导I型超敏反应无铰链区,B细胞成熟的标志,抗原A,表位1表位2表位3表位4表位5
18、,免疫动物,抗体A,抗体1抗体2抗体3抗体4抗体5,一个淋巴细胞克隆 产生一种抗体 针对一种表位,抗体A,多克隆抗体,抗体1,单克隆抗体,五、单克隆抗体,单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）：由一个B细胞克隆产生 识别一种抗原表位 高度均一（结构、特异性）杂交瘤技术制备,基本原理,小结,只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样
19、在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology）。,单克隆抗体的应用,单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病 诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成 本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜 在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不 断发展。,人源单克隆抗体,主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤
20、抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。,小结,细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融 合形成单个细胞的过程。细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇 法）和物理法（电融合法）。杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂 种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温
21、度敏感型细胞 组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的筛选。基于细胞融合的杂交瘤技术和单克隆抗体技术具有广泛的应用价值。,推荐图书,基本理论,基本实践（实验）,生物化学细胞生物学分子生物学,有机化学生理学,普通生物学,生物化学,沈同、王镜岩、赵邦悌主编，(第三版,上、下册，)，高等教育出版社出版，2003.查锡良主编.生物化学（第七版）.人民卫生出版社,2008.,细胞生物学,王金发编著，细胞生物学，科学出版社，2005.翟中和主编，细胞生物学（第二版），高等教育出版社,2002.,分子生物学,分子生物学第三版 朱玉贤，科学出版社,2007.分子遗传学孙乃恩等著，南京大学出版社,2005.,细胞及分子生物学实验,动物细胞培养基本技术指南(第4版)，作者：(英)R.I.弗雷谢尼，译者:章静波、徐存拴，科学出版社，2005.分子克隆实验指南第三版（上、下册）J.莎姆布鲁克美黄培堂译编写,科学出版社出版发行，2008.现代分子生物学实验技术,卢圣拣主编,高等教育出版社,1993.,
