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1、,数据处理流程,计算机集群,测序控制PC,测序仪,1.控制测序过程决定测序长度、填加试剂、控制温度、控制反应时间、拍照2.图像分析对测序仪拍照的图片进行图像分析，得到亮点的光强度和坐标3.basecalling由光强度得到碱基序列,4.数据传输将basecalling结果（二进制文件bcl）传输到计算机集群的存储上,5.数据处理将bcl文件转化为后续信息分析所使用的文本文件（fastq,qseq）6.index拆分7.数据质量分析8.数据备份9.后续信息分析.,图像分析及basecalling基本原理,Cycle1 Cycle2 Cycle3,对A发出的光拍照,对C发出的光拍照,对G发出的光拍
2、照,对T发出的光拍照,图像分析及basecalling基本原理,Cycle1 Cycle2 Cycle3,由4个cluster得到4条序列：ATA.CCT.GCG.GAC.,图像分析,对每个图片独立的处理图像锐化对图片进行快速傅里叶变换(FFT)，在傅里叶空间乘以滤波函数后反变换识别cluster/亮点信噪比(亮度/背景值)大于阈值的亮点区域计算亮点光强度和位置坐标在亮点区域，对光强度进行二维插值，求出最大光强度，以及最大光强度对应的位置坐标,将同一个tile的所有图片中的亮点坐标对齐重叠不同图片之间存在偏移/拉伸/压缩(offset)系统、稳定的：4种光折射率不同、滤波片不同、光路不同，所以
3、造成成像的偏移/拉伸/压缩，可利用crosstalk，计算出偏移/拉伸/压缩的数值(offset参数)偶然、随机的：flowcell表面不平、自动调整焦距、机械移动不够精确、随机振动，可利用crosstalk解决,CrosstalkAC光谱间有交叠，GT光谱间有交叠，所以：碱基A的图片中包含C发出的光碱基C的图片中包含A发出的光碱基T的图片中包含G发出的光不利：不能直接比较光强度大小而得到碱基有利：利用图片中共同的亮点，将所有图片对齐重叠，解决offset问题,图像分析流程,Template Generation利用AC之间的crosstalk、GT之间的crosstalk，将前 2个cycl
4、e的图片，与第一个cycle的A的图片对齐重叠，确定所有cluster的位置坐标(x,y),Registration and Intensity Extraction对于每一个cycle：将4张图片(ACGT)中的所有亮点与cluster坐标(x,y)对应，计算每个cluster的4种光强度,对每个图片独立的处理图像锐化、识别cluster/亮点、计算亮点光强度和位置坐标,Template Generation利用AC之间的crosstalk、GT之间的crosstalk，将前 2个cycle的图片，与第一个cycle的A的图片对齐重叠，确定所有cluster的位置坐标(x,y),图像分析结果
5、,Basecalling,Crosstalk 校正4种光强度归一化（用DNA样品计算参数）,Phasing/Prephasing校正（用DNA样品计算参数）,对于每个cluster：在每个cycle中，比较4种光强度，光强度最大的就是当前cycle测到的碱基，各cycle测到的碱基连起来组成这个cluster的碱基序列；计算每个碱基的质量值,4种光强度归一化,A,C,G,T,phasing,Sequencing primer,prephasing,Basecalling结果：qseq文件,每一行表示一条reads(一个cluster)每行有11列，tab分隔：机器编号、run序号、Lane号、
6、Tile号、X坐标、Y坐标、index标志、read1/read2标志、碱基序列、质量序列、是否通过默认的质量筛选标准 Single-end(SE)测序：1个qseq文件 Pair-end(PE)测序：2个qseq文件分别存放read1和read2的数据；2个文件的同一行属于同一个cluster 每条序列(reads)长度=上机测序循环(cycle)数量；测序cycle数量受测序试剂盒的试剂量限制，对于GA有：36SE、36+7/8SEindex、45PE、36+7+45PEindex、76PE、74+7+76PEindex、73+8+76PEindex、101PE、101+7/8+101PE
7、index 等 对于Hiseq：91PE、91+8+91PEindex、101PE、101+8+101PEindex,Basecalling结果：qseq文件,fastq文件,每4行表示一条reads(一个cluster)第一行：序列ID，包含index序列及read1或read2标志：第二行：碱基序列，大写“ACGTN”第三行：“+”，省略了序列ID第四行：质量值序列：字符的ASCII码值-64=质量值 Single-end(SE)测序：1个fastq文件 Pair-end(PE)测序：2个fastq文件分别存放read1和read2的数据；Read1的fastq文件*1.fq中第一条rea
8、ds：FC61FL8AAXX:1:17:1012:19200#GCCAAT/1CCACTGTCATGTGAACATCACAGAGACATTTCTTGA+bbbbbbbbbbabbbbbbbbbbbbbbaaaaaaaaa_Read2的fastq文件*2.fq中第一条reads：FC61FL8AAXX:1:17:1012:19200#GCCAAT/2AAAATTAGCCAGGCAATGGTGGTGCATGCCTTTAATCCCAGCTA+QVVVVYVYWWYPWYYTYYWUYYYVVWW,质量值FC61FL8AAXX:1:17:1012:19200#GCCAAT/1CCACTGTCATGTG
9、AACATCACAGAGACATTTCTTGA+bbbbbbbbbbabbbbbbbbbbbbbbaaaaaaaaa_表示方法 Illumina：字符的ASCII值-64=质量值(Sanger：字符的ASCII值-33=质量值)范围 GA Illumina1.3+(09年3月之后):2,35 B,c GA Illumina1.0(09年3月之前):-5,40;,h Hiseq:2:38 B,f质量值与错误率理论关系：Q=-10 log10(e)质量值计算方法：根据光强信号信噪比、光强度衰减、GC含量等参数，计算质量值,fastq文件,fastq文件,每条序列(reads)长度read1和rea
10、d2分别去除了最后一个碱基，即：36 SE 有效长度为 35101 PE 有效长度为 100(read1)+100(read2)101+8+101 PEindex 有效长度为 100(read1)+100(read2)Read1中所有reads长度相同，Read2中所有reads长度相同，但是Read1和Read2长度可以不相同，取决于上机测序循环(cycle)数量 质量筛选(PF)：Illumina标准流程输出的fastq文件，去除了qseq文件中没有通过默认质量筛选标准的低质量序列(reads)GA正常PF比例：DNA 8090%，RNA 7085%每个Lane的正常产量范围：GA 203
11、0M PF reads Read1和Read2各有2030MHiseq 6080M PF reads Read1和Read2各有6080M碱基总产量=Read1的产量+Read2的产量=reads数量(Read1的长度+Read2的长度),fastq文件产量（GA）,fastq文件产量（Hiseq vs GA）,文库质控问题1：Pair-end关系,800bp及以下文库,与参考序列比较或者：总之，Read1，Read2与参考序列比对结果：一正(F)一反(R)，且F的位点坐标小于R的位点坐标,Read1,总之，Read1，Read2于参考序列比对结果：一正(F)一反(R)，且F的位点坐标小于R的
12、位点坐标文库插入片段长度,F,2100检测报告文库长度分布,与参考序列比对得到insert-size分布,正常insert-size分布,基因组DNA,外显子,PCR-free文库,异常insert-size分布,2K及以上文库,文库质控问题1：Pair-end关系,与参考序列比较或者：总之，Read1，Read2于参考序列比对结果：一正(F)一反(R)，且F的位点坐标大于R的位点坐标,正常insert-size分布,2K,56K,PCR-free文库,10K,异常insert-size分布,文库问题2：adapter污染,空载：adapter与adapter直接连接，中间没有插入片段，导致r
13、ead1测到3adapter，read2测到5adapter的反向互补reads尾部测到adapter 插入片段过短插入片段长度小于上机测序循环(cycle)数，导致read1尾部测到3adapter，read2尾部测到5adapter的反向互补,adapter空载较多导致碱基含量波动,客户PCR引物污染导致碱基含量波动,文库质控问题3：文库随机性,GC含量偏差：实验技术（打断、PCR、测序）本身特点，导致高GC和低GC区域测序覆盖度偏低，甚至某些区域覆盖不到；PCR-free建库技术可减少PCR带来的随机性问题 duplication PCR扩增出很多一模一样的母版分子，测序结果中很多条re
14、ads是一样的；基因组自身重复序列含量高导致duplication偏高；数据量越大，duplication比例越高,文库质控问题4：其它物种、样品污染,测序质控问题,raw Cluster密度 正常raw Cluster密度：2030万/GAtile，200350万/HiSeqtile Cluster制备时，控制文库浓度，达到适当的raw Cluster密度 密度过低产量低；密度过高质量差 样品差异：200小片段能够容忍的密度较高，800bp片段以及RNA样品、特殊样品，应适当降低密度 通过默认质量筛选标准比例(PF)用read1前25cycle的信噪比进行筛选；正常PF比例：DNA 80%，
15、RNA 70%；raw Cluster密度越高，PF比例越低；当raw Cluster密度超高时，图像分析识别出的raw Cluster数量小于真实值，此时PF比例会低于正常；,测序质控问题,光强度信号 受到环境温度、测序仪温度控制、测序仪聚焦、CS试剂、测序试剂、样品等因素共同影响；测序长度越长，光强度降低越多；碱基含量不均匀的样品，光强度会有波动，但属于正常 碱基含量 样品本身 测序问题导致有偏向性的测序错误 质量值 Q20：质量值大于等于20的碱基数量/所有碱基数量 reads尾部质量低 Error-rate 与参考序列比较，能够map的reads中：错误的碱基数量/(正确的+错误的碱基总数)；与参考序列质量有关；人、小片段文库：101PE 1%2%环化大片段error-rate高于小片段文库 reads尾部error-rate高,正常光强度、碱基含量、质量值、Error-rate,异常光强度、碱基含量、质量值、Error-rate,异常光强度与碱基含量,
