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1、方法比较试验,一.实验目的,1.掌握本实验的实验原理；2.掌握两种不同操作方法的操作过程；3.了解血清葡萄糖测定的临床意义；4.学会应用分光光度计对各组数据进行统计处理。,二.实验原理,方法比较试验是将候选方法与准确度已知的方法（如参考方法或经典方法）作对比分析,同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差值，以评价候选方法的准确度，是考核候选方法是否可被采用的重要试验。用于检测候选方法的恒定误差和比例误差，如对适当的数据进行分析也可以提供误差的性质，本实验以邻甲苯胺法作为比较方法，评价GOD-POD法测定血糖的总系统误差,邻甲苯胺法测定血糖原理：,在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺(O-
2、T)缩合成糖基胺，经脱水，生成希夫碱（Schiff base），经分子重排生成蓝绿色化合物，在630nm波长处有一吸收峰，吸光度大小在一定范围内与血糖浓度成正比。邻甲苯胺+葡萄糖 葡萄糖基胺 希夫碱 蓝绿色化合物,缩合,脱水,三.试验试剂器材,1.邻甲苯胺试剂2.GOD-POD法试剂盒3.待测血清 四种含血糖浓度不同的血清：2.2mmol/L、6.7mmol/L、5.2mmol/L、3.7mmol/L.4.葡萄糖标准液（5.55mmol/L）5.其它：移液器、可见分光光度计、水浴箱等,四、操作步骤,1每人随机选择血糖含量高低不同的病人血清标本2份。2将每份标本分别用两种方法各测定2次。将标本按
3、某次序排列先测一次，第2次测定时，标本顺序全部倒过来。例如，第1次序号为1、2、3、4、5、6、7、8，第2份序号为8、7、6、5、4、3、2、1。3计算出两法各自的测定结果,具体操作如下：,GOD-POD法；加入物 空白管 S(标)U1(测)U2(测)DDW 10ul-5mmol/L(糖标)-10ul-待测血清-10ul 10ul 试剂（酶酚）1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 混匀后置370C水浴15min,于505nm处比色，空白管调零，读取吸光度值。,O-T法(邻甲苯胺法)；,加入物 空白管 S(标准管)U 1(测)U2(测)DDW 0.1ml-5mmol/L糖标-0.1m
4、l-待测血清-0.1ml 0.1ml 邻甲苯胺试剂 3ml 3ml 3ml 3ml 混匀后放入沸水中煮沸5min，取出置冷水中冷却3min，于630nm处比色，以空白管调零，读取吸光度值。,五、结果计算,测定管吸光度血清葡萄糖=5mmol/L 标准管吸光度【参考范围】空腹：3.896.11mmol/L；餐后2h：7.8mmol/L。,数据处理,1设对比方法测定结果为X值，候选方法测定结果为Y值。若有n个标本，则有2n对X和Y的测定结果。2离群点检查：先计算每一标本每一方法成对结果的差值和差值的均值。以4倍的各方法差值的均值为判断限，各方法内标本的成对差值都应在限值内，说明双份测定结果符合要求。
5、若有1点离群点，剔除。若原数据仅为40例病人标本的结果，剔除的数据应另做实验补上。有一点以上离群点，需查原因，判断是否保留数据。无法找出原因，则保留使用所有数据，不能随意剔除。若最大差异超过临床允许误差，应从仪器、试剂、方法上寻找原因，停止继续实验。,3绘制散点图：以X轴代表对比方法的测定值，Y轴代表被评价方法的测定值，图中标出斜率为1通过零点的直线。4如果实验结果线性关系良好，继续处理。如果呈非线性趋势，则需要观察是否有部分呈线性关系，寻找修正点，使余下的部分具线性趋势。但应考虑这部分是否包括了临床上有用的范围，是否需再多做一些在此范围的标本结果。如去掉非线性部分后，范围过小，无应用价值，则
6、停止评价。,5X、Y配对值离群点检查：将每一个标本两个方法的前后两个测定值一一对应，求出第i个X与第i个Y的差值，并计算出所有标本总的平均差值，以4倍的平均差值为判断限值。所有差值都不应超出限值。若有离群点，按步骤2中的方法处理。6统计学处理及误差分析 直线回归分析：对上述n个标本，2n对（Xij、Yij）数据以回归方程式ya+bx表示。a为回归直线在Y轴上的截距，代表恒定误差的大小；b为回归系数，即直线的斜率，代表比例误差的大小。,a和b的计算公式分别为：,如果两方法表示的某分析物量具相同的计量单位时，理想状态的回归式应为yx，即b=1，a=0。b1，a0分别表示两方法间的测定标本时的比列误
7、差和恒定误差。相关性分析：,相关系数r=,求出的相关系数还应作相关系数的t检验。相关系数(r)的t检验统计学公式是：,将方法比较试验的原始数据(x和y值)求得的相关系数r及例数(n)代入t检验的统计学公式，即可求出相应的tr值，再按照n-2的方法计算出自由度(v)，查t值表求得t0.05(v)及t0.01(v)相应的t值，若trt0.05(v)，P0.05，说明实测的相关系数(r)与0之间差异显著，两种测定方法的测定结果之间存在相关关系；若trt0.01(v)，P0.01说明实测相关系数(r)与0之间有非常显著的差异，两种方法的测定值之间存在着高度相关关系。,7。方法比较试验的数据属于配对资料
8、，因而可 作配对资料的t检验。,差值标准差(Sd),自由度(V)n-1 差值标准差中的d代表候选方法与参考方法测定值的差值，为差值之平均值，n为配对数。判断：若求得t值t0.05(v)，即P0.05，表示候选方法存在显著的系统误差。,六、注意事项,1对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法，这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选方法。在整个实验中，保持候选方法和比较方法都处于完全质量控制下，始终对实验结果有校准措施。2实验时间至少做5天，时间长一些更好；标本至少选择40份病人，多一份更好。实验的可靠性和有效性随时间延长和更多的标本量而增加。尽可能使50%的实验标本内分析物含量不在参考区间
9、内，各个标本内分析物含量分布越宽越好。,3最好使用当天采集的标本，若需保存标本，应确保它们的稳定性。只使用一种保存条件，能符合两个方法的要求，以免条件不一引出新的变异。4方法学比较试验时，随时将实验数据点在分布图，发现异常值即复做，及时纠正，可减少离群值出现的机会。5.实验方法 在做双份第二次实验时，标本顺序全部倒过来，应在4h内完成测定。,七、方法学评价,对比资料的相关系(r)常用来表示两个变量间互相关系密切的程度，并不能指明有无恒定误差和比例误差。直线回归统计时，除了所有实验点和回归线间的离散度会影响r值的大小外，实验点对应的分析物含量分布宽度也会明显影响r值的大小。若实验点过于密集，尽管
10、离散度不大，但r值偏小。因此，可用r检验X取值范围是否适当。一般要求r0.975（或r20.95），认为X范围是适合的。若r0.975，应收集更多标本再继续实验，使数据分布范围增大。依据r值大小来判断两种比较方法分析结果符合程度时应持谨慎态度，相关系数好，但斜率和截距仍然受离群值和非线性以及数据分布范围的影响。,八、可接受性判断,评价实验完成以后，应写出书面报告，确定方法评价的结论。候选方法可否被接受，最后根据评价实验中的误差结果进行归纳，作出判断。根据“可允许误差的95%限度”，计算各项误差与其比较，任何一项指标大于可允许误差都不能被接受。,只有在假设所有实验结果是绝对正确的前提下，才能进行上述计算。为了在适当的样品数下，能以最小的代价取得实验误差测定的最大可靠性，可用可信区间判断指标。使用可信区间判断指比较复杂，但能对方法性能提供更客观的决定，起最后判断作用。评价报告中除了要叙述操作方法(包括试剂配制和所用实验器材)以外，应着重写明候选方法的各项分析性能指标，要特别重视实验数据的科学整理和客观陈述。实事求是，对候选方法的优点要充分肯定，对其缺点和存在的问题也要如实指出,
