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1、时间分辨荧光免疫分析技术培 训,上海新波生物技术有限公司,问 题,时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。TRF的标记物及特点。为什么叫“时间分辨”?TRF在免疫分析方法学中的地位。,标记免疫学发展历程,放射免疫（精度：10-12mol/L）酶联免疫（精度：10-9 mol/L）化学发光（精度：10-15mol/L）电化学发光（精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）生物芯片（未知）,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs(药物浓度),Thyroid Hormone(甲
2、状腺激素),Fertility Hormone(孕激素),Cancer Markers(肿瘤标记物),Infectious Disease(传染病),Vitamins(维生素),Serum Proteins(血清蛋白),10-12,10-9,10-6,10-3,10-0,各种免疫方法学的比较,放射性免疫分析法（RIA）,应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。,缺点放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导
3、致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。,酶免疫分析法（ELISA）,应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术曾经一度被认为是取代放免的检测手段。,缺点灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。,化学发光免疫分析法（CLIA）,应 用单个样本检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。仪器种类：拜耳 ACS180 系列雅培 AXSYM贝克曼 ACCE
4、SS德普 IMMULITE,缺 点样品不能重复检测；出现故障则整批试剂及血样报废。本底较高，易受环境物质干扰。仪器故障率较高。标准曲线稳定性较差，需多次定标。检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂；试剂价格高。,电化学发光免疫分析（ECL）,应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。,缺点非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。,时间分辨荧光免疫（TRFIA）（Time-Resoled Fluoroimmunoassay）,时间分辨荧光免疫的
5、基本原理,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的物理特点（特异性强、Stokes位移大、寿命长），并采用解离-增强技术（DELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据已知浓度所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。,乙肝表面抗原免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝表面抗体免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝抗原免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝抗体免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝核心抗体免疫反应图（时间分辨荧光法
6、）,时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）,光 路 图 简 介,氙灯,紫外滤光透镜,分束器,样品杯,滤光片,PMT,负反馈,标记物为具有独特荧光特性的稀土金属-镧系元素,镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、铽(Te)镧系元素荧光特点：荧光寿命极长镧系元素螯合物（60900 us)普通荧光免疫中荧光团：1100ns样本中蛋白质荧光：110ns，易猝灭。Stokes位移大（大约290nm）铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为28nm荧光特异性强。（发
7、射光谱带很窄：615 5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使本底达到0,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光。而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0,利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。,DELFIA技术为临床检测带来的先进性,不 同 标 记 物 的 波 长,0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L,5,100,2000,Cps.10 3,时间分
8、辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标,DELFIA hFSH,标准曲线稳定，试剂保质期长,N=6,时间分辨荧光免疫的试剂种类,甲状腺功能检测TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG性激素类检测FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG肿瘤标记检测AFP，CEA，CA-153，CA-125，CA-199遗传科检查产前筛查：hAFP/HCG，PAPPA新生儿筛查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU传染病检测HBsAg、HBsAb、HBeA
9、g、HBeAb、HBcAb、HBcAb-IgM、HCV、HIV、TP血液科检测贫血检查：Ferritin，Vit B12，Folic acid科研工具单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测,时间分辨荧光免疫-突出优点,零本底、灵敏度高线性范围宽试剂有效期长标准曲线稳定性好易于自动化,TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。,公司简介,上海新波生物技术有限公司是一家新近成立于上海浦东张江高科技开发区的高新技术企业，是国际上少数几家掌握“时间分辨荧光免疫”检测技术的厂家之一。新波生物致力于这一新技术的研究，现已在方法学研究、试剂合成、标记物的制备、
10、抗原抗体纯化、检测仪器的生产等方面均取得了很大成果。2000年在国内首家推出了ANYTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统，并列为上海市高新技术项目；与此仪器配套的试剂种类多达82种，其中58项用于临床检验、24项用于科研。,半自动 ANYTEST2000,Anytest2000 时间分辨检测仪,ANYTEST2000 主要特点,试剂的多样性种类多达82种，其中临床58项、科研24项每年推出新诊断试剂盒（根据客户不同需求而开发）仪器的先进性 高灵敏度：10-18 mol/L（Eu 3+）线性范围宽：10-13 mol/L 10-18 mol/L高稳定性：1%快速测试：1秒样标本量灵活：适合
11、每天1400份标本量适用范围：各类大小型的医院、生化实验室应用于临床检测和科学试验标准曲线、测试数据长期保存、共享智能化操作软件 价格的可比性 进口试剂国内分装价格与进口酶标试剂可比性专为中国设计的仪器价格与进口计数仪的可比性,ANYTEST2000智能化操作界面,友好的主界面简洁的操作过程强大的数据处理,时间分辨法检测“乙肝五项”的意义,原子标记、灵敏度高，有效区分弱阳性与阴性血样。二步法的采用，最大限度避免HOOK现象出现。（强阳性血样检测为阴性）定量检测可以动态观察治疗效果。量化评估乙肝疫苗接种效果。结果准确、价格适中。,新技术的挑战,放免其必然受到一代新的更灵敏、稳定、快速，而且全自动化的测量技术的挑战。但取代它的决不是发色酶标，因其技术指数尚不及放免。从90年代开始放免分析在国际上每年以 1015%的速度下降，这是事实。一些大型的实验室，标本量大的项目都已逐步应用各种非放免标记的自动化设备来进行分析，这是技术发展的必然规律。我们必须清醒地分析趋势，迎接新技术的挑战和带来新的曙光。,
