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1、第七章 昆虫病毒,地球上的昆虫可能达1000多万种，约占地球生物多样性的一半，已命名的约100万种。中国估计有60-100万种，但已记载的只7万种左右。,第八章 昆虫病毒,一、昆虫病毒的研究二、昆虫病毒的类型三、昆虫病毒的一般特性四、昆虫病毒对有益昆虫的危害五、杆状病毒(Baculovirus),一、昆虫病毒的研究,高尚荫(1909-1989)中国科学院院士，病毒学家从事TMV、流感病毒、昆虫病毒等研究,中国科学院院士朱既明医学病毒学家田波植物病毒学家谢联辉植物病毒学家毛江森医学病毒学家,裘维藩(1912-2000)中国科学院院士，植物病理学家，北京农业大学教授，完成中国第一部植物病毒学专著,
2、研究昆虫病毒的意义,茶树害虫的幼虫、蛹、成虫和卵,小菜粉蝶(菜青虫),昆虫病毒的种类繁多，涉及11个目的900多种昆虫，据统计我国已经发现的昆虫病毒有200余株。,二、昆虫病毒的类型,根据“Virus taxanomy1999”，昆虫病毒可分为7个科:,1、杆状病毒科（Baculoviridae）核型多角体病毒属（Nucleopolyhedrovirus）颗粒体病毒属（Granulovirus）2、呼肠孤病毒科（Reoviridae）质型多角体病毒属（Cypovirus）3、痘病毒科（Poxviridae）昆虫痘病毒亚科（Entomopoxvirinae）4、细小病毒科（Parvovirida
3、e）浓核病毒亚科（Densovirunae）5、虹彩病毒科（Iridoviridae）虹彩病毒属（Iridovirus）6、弹状病毒科（Rhabdoviridae）西格马病毒属（Sigmavirus）7、微核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Entervirus）,二、昆虫病毒的类型,属于13个病毒科、2个病毒亚科、21个病毒属。病毒核酸的类型分为：DNA病毒dsDNA病毒，包括:杆状病毒科；多分DNA病毒科；痘病毒科；泡囊病毒科；虹彩病毒科。DNA病毒ssDNA病毒包括细小病毒科。DNA和RNA反转录病毒，包括:前病毒科：变位病毒科。RNA病毒dsRNA病毒，包括:呼肠
4、孤病毒科：二分RNA病毒科RNA病毒ssRNA病毒，包括:微RNA病毒科；野田村病毒科；T4病毒科,三、昆虫病毒的一般特性,(1)大多数昆虫病毒能形成包含体，病毒粒子封闭在包含体中,包含体的主要成分是蛋白质。包含体的特性：在许多有机溶剂中不溶解（酒精、乙醚、氯仿、苯和丙酮），对蛋白酶抗性强，但它们溶解于碳酸钠、氢氧化钠、氨的水溶液中。在自然条件下比较稳定，落到土壤中的包含体病毒能保持活性多年对高温敏感，对阳光和紫外线也缺乏抵抗力，一般的消毒剂也可使包含体病毒失活。,根据包含体在寄主细胞中的部位，分为：,核型多角体病毒(NPV，nuclear polyhedrosis virus)：寄生在寄主细
5、胞核内，包含体内含有多个杆状病毒粒子。质型多角体病毒(CPV,cytoplasmic polyhedrosis virus)：寄生在寄主细胞质中，包含体内含有多个球状病毒粒子。颗粒体病毒(GV，granulosis virus)：在感染的细胞核里和细胞质里均可发育形成。多为椭圆形，也有肾形。每个包含体一般仅含一个杆状病毒粒子。无包含体病毒：如昆虫浓核病毒，感染病毒的宿主细胞核膨大，核内物质呈浓密、丰盈现象。昆虫痘病毒（Vagoiavirus）:椭圆形与纺锤形包涵体存在于细胞质内，但纺锤形包涵体是不包埋病毒粒子的.,(2)昆虫病毒主要是通过口器感染(3)有些昆虫是植物病毒的介体，一般对介体 昆虫
6、无害(4)昆虫病毒可用于害虫的生物防治优点：缺点：,（1）宿主特异高 能杀灭害虫，而不影响害虫的天敌，引起主要害虫的再猖獗与次要害虫上升等可能性较小；（2）不会污染环境，对人畜安全 昆虫病毒是自然界本来存在的，特别杆状病毒（核型多角体病毒与颗粒体病毒）对河虾、牡蛎、蚌、蟹没有致病性，对两栖类、鱼类、鸟类及哺乳动物也无任何中毒性、致病性或异常变态反应；（3）后效作用明显 不仅病虫本身就是病毒生产的“小工厂”，而且有些情况下，病毒还可经卵传染，杀灭次代害虫，化学农药无此特点。（4）生产容易、使用方便、成本低廉、适于推广,三、昆虫病毒的一般特性,昆虫病毒可用于害虫的生物防治中科院武汉病毒所研究成功生
7、物导弹新技术，防治松毛虫获得成功。利用卵寄生赤眼蜂特有的行为特点，结合昆虫病毒流行病学规律，通过卵寄生蜂将经过高新技术处理的强毒力病毒制剂传递到靶害虫卵表面，使初孵幼虫罹病死亡。既能有效地控制害虫大发生，又可以保护天敌，不污染环境，对人畜安全无害。,三、昆虫病毒的一般特性,“生物导弹”,以卵寄生蜂为媒介传递病毒防治害虫,用柞蚕卵来繁殖赤眼蜂,并将研制的适应赤眼蜂携带的病毒剂型均匀地雾化喷洒在柞蚕卵表面。当赤眼蜂咬破壳从蚕壳爬出来时,每个蜂身上可粘上数百个病毒。赤眼蜂能迅速准确地找到害虫卵作为寄生卵,贴近害虫卵壳的同时,病毒粘到卵壳上,使害虫种群发生病毒性流行病。只用5枚生物导弹就可控制一亩地范
8、围的松毛虫流行;持续期长,一次防治多年受益。实施方法简单：将半个火柴盒大小的“生物导弹”挂在树木一人高处。,昆虫病毒生产过程,斜纹夜蛾病毒杀虫剂及甜菜夜蛾病毒杀虫剂：一种核型多角体病毒（NPV）,饲养昆虫病毒感染收集病毒,病毒杀虫剂生产工艺（以NPV杀虫剂为例）,病毒杀虫剂生产工艺（以NPV杀虫剂为例）,五、杆状病毒(Baculovirus),有包膜的超大双链闭合环状DNA病毒(135k bp)分类上独立为杆状病毒科(Baculovidae),分3个属：多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus)颗粒体病毒属(Granulovirus)非包埋杆状病毒属(Nonoccluded Ba
9、culoviruses)目前至少从600多种昆虫和其他无脊椎动物中发现各种病毒的感染调节种群密度感染病毒的幼虫形成大量包含体，扩散、传播杆状病毒有宿主专一性，对脊椎动物、植物完全不感染应用安全,主要见于昆虫体内，是已知昆虫病毒中类群最大、发现最早、研究最多，且实用意义最大的。主要应用:作为载体，表达外源基因;作为杀虫剂，有效地控制农业害虫的发生，并且对环境不造成污染。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Californica Nuclear Polyhedorosis Virus,AcMNPV)研究得最深入。,五、杆状病毒(Baculovirus),形态特征：包含体：核多角体、颗
10、粒体病毒粒子:有包膜、产生2种：芽生型bubed（早期）和包埋型occluded（晚期）病理学特征：宿主仅限于节肢动物动作迟缓、食欲减退、虫体肿胀，轻触即破，流出浓汁（无臭），倒悬而死。可入侵中肠组织、进入血淋巴及其他组织从感染到死亡需57d。,五、杆状病毒(Baculovirus),昆虫杆状病毒表达载体系统 Baculovirus Expression Vector System，BEVS,80S初，国外学者发现多角体蛋白基因（polh)的强启动子及晚期大量表达的特性，Smith等首次建立了AcMNPV/秋黏虫细胞表达系统，表达了人干扰素。从此，以杆状病毒作为载体，在昆虫细胞或虫体内表达外源
11、基因，形成了BEVS。,五、杆状病毒,早期的BEVS有很多不足，如：重组率较低 筛选困难 操作周期长 产物不易纯化等短短20多年时间里，随着杆状病毒分子生物学研究的不断深入，杆状病毒表达系统迅速发展，不断完善，已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析及各种生物活性物质的制备等方面发挥着越来越重要的作用。,五、杆状病毒,构 成,通常BEVS由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成，其技术路线分以下几步：先将外源片段克隆到载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列（flanking secquence)，构建成转移
12、载体；把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组，再以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。最后空斑纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化所表达的外源蛋白。,五、杆状病毒,优势（与细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比）：,多角体基因启动子下的超高表达效率；表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性；可同时表达多个外源蛋白，来源遍及动物、植物、细菌真菌和病毒；能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖；蛋白产物易从无血清的培养上清中纯化，无内毒素污染；生物安全性高，对植物和脊椎动物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱。,五、杆状病毒,了解昆虫病毒的特点及其应用,昆虫病毒,
