《有害物质检测》PPT课件.ppt

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1、第十章 食品中有害物质的检测,第一节 概论一、有害物质与有毒物质的概念有害物质：当某物质或含有该物质的物料被按其原来的用途正常使用时，若因该物质而导致人体机能、自然环境或生态平衡遭到破坏，则称有害物质。从对人健康影响的角度可将有害物质分为普通有害物质、有毒物质、致癌物和危险物有毒物质：凡是以小剂量进入机体，通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的物质,二、食品中有害物质的种类与来源,生物性有害物：AFT、李斯特菌、口蹄疫致病菌化学性有害物：DDT，TTX,重金属，放射性元素物理性有害物：金属屑，石子，动物排泄物来源？,三、加强食品中有害物质检测的必要性,与WTO接轨对安全性要求越来越高,第二节

2、 食品中有害物质常用的检测方法,薄层色谱法,气相色谱法,高效液相色谱法,质谱法,色质联用,酶联免疫吸附剂测定,一 薄层色谱法（TLC）,原理：用Rf值定性分析普通硅胶表面是极性硅醇基能与极性化合物形成氢键而表现出吸附性能，用于分离非极性或极性较小的物质，属于正相键合。改性硅胶根据键合的键不同，与-CN,-NH2,-(OH)2等为正相键合，与十八烷基、辛烷基、乙基为反相,二、气相色谱法（GC）,三 高效液相色谱法（HPLC）,流动相为液相，采用不锈钢柱及高压促流，而且填充料的粒径小而均匀，达到快而重复性好的高效效果。不同于传统的玻璃柱和重力引流的慢而重复性差的普通色谱柱,四 质谱法（MS）,使所

3、研究的混合物或单体在一定条件下形成气态离子，使之通过依赖电磁场作用的质量分析器，使各离子按质荷比大小的不同依次到达收集器并产生信号，经过检测记录即可得到这些离子峰的信息,五 色谱-质谱联用技术,质谱仪灵敏度高，定性效果好，但只能对单一组分色谱仪对混合物组分分离和定量有显著优势两者联用的关键问题：解决色谱的流出物与质谱相连的接口转换,六 酶联免疫吸附剂测定（ELISA）,采用酶标记的抗体或抗原与样品中的抗原或抗体间进行的抗原-抗体反应优点：快速定性，特异性强，灵敏，一次多份（在酶标板上）用于激素、抗生素等的分析,第三节 食品中农药残留及其检测,农药是农业生产中使用的各种药剂统称，种类很多。我国农

4、药生产现状及发展趋势：目前全世界实际生产和使用的农药的品种为500多种，其中大量使用的有100种，主要是化学合成生产的。,农药包括：杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂。我国已由农药进口国变成农药出口国。,我国现有主要农药合成企业近400家，已建成700千吨以上原药生产装置，可常年生产250多种原药、农药中产量居世界第二位（美国第一），农药产量呈逐年增长的趋势。,新品种与新工艺不断出现。常用的有：有机磷农药、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等。杀虫剂有胺丙畏、苯胺硫磷等。杀菌剂有腐霉利、乙霉威等。,除草剂有丙草胺、麦草畏等。生长调节剂有烯效唑、多效唑、油菜素内酯等。生物农药发展迅速。,1、产品结构不合

5、理，个别品种老化 杀虫剂 杀菌剂 除草剂我国 68.5%10.4%18.3%发达国 40%20%40%,农药加工剂型增多，主要有乳油、粉剂、粉粒剂、悬浮剂、水剂、片剂、烟剂等。原料及中间体已经满足国内需求。存在问题：,2、农药加工落后，助剂研究滞后 我国原药与制剂比例较低，目前为1：9但发达国家为1：10303、生产规模小，工艺技术落后，产品质量差 我国农药产量约占全球的25%但销售额不足8%4、生物农药还应大力发展。,农药在防治农作物病虫害、控制人类传染病、提高农畜产品的产量和质量以及确保人体健康等方面，都起着重要的作用。但是，大量广泛用农药也会造成对食物的污染。农药残留是指农药施用后，残存

6、在生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢产物、降解物和杂质的总称。残留的数量叫残留量。,农药进入人体的方式,土壤、水、空气,家禽、畜,植物、饲料,水生动、植物,肉、蛋、乳,人,食品中普遍存在农药残留,残留量随食品种类及农药的种类不同而有很大差异，由于农药的毒性都很大，有的还可在人体内蓄积，对人体造成危害。食品中残留农药过高会导致癌症和帕金森症。1994 年，我国农药中毒人数已超过10万人，大部分是由于农药残留而引起。,容易吸收农药的蔬菜,番茄、茄子、圆辣椒、卷心菜、白菜及大多数根菜类、薯类。对农药吸收率较低的 叶菜类、果类等。,为提高食品的卫生质量，保证食品的安全性，保障消费者身体健

7、康，许多国家都对食品中农药允许残留量作了规定。表13l和132分别为我国和WHO制订的有机氯农药六六六、滴滴涕在食品中的允许残留量标准；表133为我国制订的有机磷农药在食品中允许残留量标准；表13 4为FAO/WHO推荐的部分食品中有机磷农药允许残留量标准。,小资料：我国全面禁用5种高毒农药包括：甲胺磷、久效磷、甲基对硫磷、对硫磷、磷胺。,食品中农药残留量的分析方法：1)比色法 少特异性，灵敏度很低，分光光度法 已很少使用 电化学分析2）纸色谱 TLC 3）GC 电子捕获检测器 适用有机氯农药。4）HPLC 非挥发性、热不稳定性农药，如 部分有机磷农药。5）GC/红外光谱 联用、GC/MS 联

8、用。,一、有机氯农药残留量的检测（一）有机氯农药的性质及常见品种,有机氯农药是农药中一类有机含氯化合物，一般分为五大类：1、DDT类氯化苯及其衍生物，包括DDT、六六六。,2、氯化甲撑萘类七氯、艾氏剂、狄氏剂。3、七O五四 纯品为白色晶体，微溶于水，易溶于某些有机溶剂。主要用于杀灭蚊蝇。蓄积在动植物脂肪中，通过食物链进入人体。中毒症状为乏力、失 眠、眩晕、恶心等，长期接触可影响中枢 神经系统及肝脏。,4、氯丹 纯品为无色或淡黄色液体，微溶于水，易溶于某些有机溶剂。中毒情况同7054 5、林丹（又名高丙体六六六）本品为无色晶体，不溶于水，溶于大多数有机溶剂。中毒情况同7054。主要用于粮食、蔬菜

9、、果树、烟草、森林、粮仓。目前仍有一些国家（包括我国）使用林丹由于有机氯性质稳定，在水域、土壤中仍有残留，并会在较长时间内继续影响人类健康。,有机氯农药的结构及理化性质,（1）六六六 六六六分子式为C6H6Cl6，化学名为六氯环己烷、六氯化苯，英文名为Benzene hexachl oride(简称 BHC)。BHC有多种异构体，其常见的异构体化学结构式为：,BHC为白色或淡黄色固体，纯品为无色无臭晶体，工业品有霉臭气味，在土壤中半衰期为2年，不溶于水，易溶于脂肪及丙酮、乙醚、石油醚及环己烷等有机溶剂。BHC对光、热、空气、强酸均很稳定，但对碱不稳定(BHC除外)，遇碱能分解(脱去HCl)。C

10、6H 6Cl6十3KOH C6H3Cl3十3KCl 十3H2O,(2)滴滴涕 滴滴涕分子式为C14H9Cl15，化学名为2，2双(对氯苯基)1，1，1一三氯乙烷、二氯二苯三氯乙烷，简称二二三，英文名为Dichlorodiphenyl trichloroethane，简称DDT。根据苯环上Cl的取代位置不同形成如下几种异构体：,DDT产品为白色或淡黄色固体，纯品DDT为白色结晶，熔点108.5109，在土壤中半衰期310年，（在土壤中消失95%需1633年）。不溶于水，易溶于脂肪及丙酮、CCl4、苯、氯苯、乙醚等有机溶剂。DDT对光、酸均很稳定，对热亦较稳定，但温度高于本身的熔点时，DDT会脱去

11、HCl而生成毒性小的DDE，对碱不稳定，遇碱亦会脱去HCl。,1874年人工合成DDT，1939年瑞士化学家穆勒发现了DDT的杀昆虫作用，并因此获得了1948年的诺贝尔奖。在二次世界大战中及战后的欧洲和亚洲，DDT用于杀灭传播疟原虫的蚊子，挽救了数千人的生命。,DDT在生物体内富集作用很强。例如水鸟体内DDT残留为25 mg/kg，DDT污染的水要高出8001000万倍。DDT的污染是全球性的，在人迹罕至的南极的企鹅、海豹、北极的北极熊、甚至未出世的胎儿体内均可检出DDT的存在。,样品的予处理,1.提取：以石油醚作主体溶剂，加入极性较大溶剂搭配，以索氏法或浸渍法提取含脂肪高的：用石油醚乙醚直接

12、提取含水分高的动物性食品：加无水硫酸钠研磨，再用石油醚提取果蔬：加入丙酮（穿透性强），过滤得滤液，加硫酸钠溶液（增强丙酮极性，有利分层），再用石油醚提取,蛋类：用丙酮-己烷提取牛奶：乙醇-草酸钾处理（破坏脂肪膜，释出脂肪），再用石油醚提取,2.净化,用H2SO4磺化处理，除脂肪、蜡质、色素等。石油醚：硫酸=1：1柱层析：合理选择层析材料液液分配法：以乙腈-己烷为例，将乙腈加入到己烷溶液中，有机氯农药从己烷层转移到乙腈层中，脂肪、色素、蜡质仍留在己烷层。再将乙腈层放入另一洁净分液漏斗中，加水，使乙腈浓度不大于20%，加纯净己烷，振摇分液漏斗，农药又进入己烷层，从而达到净化目的,3.浓缩,以无水硫

13、酸钠脱水，减压蒸馏浓缩到一定程度；或采用KD减压浓缩。检验标准 GB/T 5009.19,（二）GC-ECD法测定有机氯农药残留（三）TLC法测定有机氯农药残留,二、有机磷农药残留及其检测,(一)有机磷农药的特性及种类 1常见的有机磷农药及其结构 有机磷农药(Organophosphorus Pesticides)是农药中一类含磷的有机化合物，其种类很多，目前大量生产与使用至少有60多种，按其毒性可分成高毒、中等毒及低毒三类；按其结构则可划分为磷酸酯及硫代磷酸酯两大类，其结构通式如下：,根据R，Rl及X等基团不相同，可构成不同的有机磷农药。2有机磷农药的理化性质 有机磷农药中，除敌百虫、乐果为

14、白色晶体外，其余有机磷农药的工业品均为棕色油状。有机磷农药有特殊的蒜臭味，挥发性大，对光、热不稳定，并具有如下性质：,溶解性：由于各种有机磷农药的极性强弱不同，故对水及各种有机溶剂的溶解性能也不一样，但多数有机磷农药难溶于水，可溶于脂肪及各种有机溶剂，如疏水性有机溶剂：丙酮、石油醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷及苯等，亲水性有机溶剂；乙脂、二甲基亚砜等。,水解性：因有机磷农药属酯类(磷酸酯或硫代磷酸酯)，故在一定条件下能水解，特别是在碱性介质、高温、水分含量高等环境中，更易水解。如敌百虫在碱性溶液中易水解为毒性较大的敌敌畏。,氧化性：有机磷农药中，硫代磷酸酯农药在溴作用下或在紫外线照射下，分子中S易

15、被O取代，生成毒性较大的磷酸酯。,样品预处理 1.提取 一般根据有机磷农药与样品的种类，选择适当的提取溶剂与提取方法。用乙腈、丙酮、氯仿或二氯甲烷等提取。,2净化 将样品提取液经乙晴或二甲基亚砜分配提取后，再用柱色谱净化，柱中吸附剂可由活性炭、氧化铝、弗罗里矽土、无水Na 2SO4或硅藻土等按一定比例组成。,目前，国际上许多国家与组织(包括FDA，AOAC)FDA美国食品药物管理局。大量使用由storher相wans在1965年提出的，后经多次改进的扫集共蒸馏法(sweepcodistillation)来净化有机磷农药样品提取液。3.浓缩KD减压浓缩。,（二）有机磷农药的检测GC法测定 氮磷检

16、测器。几种有机磷农药的检验标准：马拉硫磷 GB/T 5009.36倍硫磷 GB/T 5009.20甲胺磷 GB14876,(一)氨基甲酸酯类农药的性质及常用品种 氨基甲酸酯类农药可视为氨基甲酸的衍生物，氨基甲酸是极不稳定的，会自动分解为 C02和 H20，但氨基甲酸的盐和酯均相当稳定，该类农药通常具有以下通式：,三、氨基甲酸酯类农药残留及其检测,R2 RlOOC-N CH3,R2是氢或者是一个易于被化学或生物方法断裂的基团。大多数氨基甲酸酯类的纯品为无色和白色晶状固体，易溶于多种有机溶剂中，但在水中溶解度较小，只有少数如涕灭威、灭多虫等例外。氨基甲酸酯一般没有腐蚀性，其贮存稳定性很好，只是在水

17、中能缓慢分解，提高温度和碱性时分解加快。,常见的氨基甲酸酯农药有：甲萘威(carbaryl)、戊氰威(Nitrilacarb)、呋喃丹(carbofuran)、仲丁威(Fenobucarb)、异丙威(Isoprocarb)、速灭威(Metolcarb)、残杀威(Propoxur)、涕灭威(Aldicarb)、抗蚜威(Pirimicarb)、灭虫威(Methiocarb)、灭多威(Methomyl)、恶虫威(Bendiocarb)、硫双灭多威(Thiodicarb)、双甲眯(Amitraz)等。,这些氨基甲酸酯农药在农业生产与日常生活中，主要用作杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀软体动物剂和杀线虫剂等。

18、20世纪70年代以来，由于有机氯农药受到禁用或限用，且抗有机磷农药的昆虫品种日益增多，因而氨基甲酸酯的用量逐年增加，这就使得氨基甲酸酯的残留情况备受关注。,(二)氨基甲酸酯类农药残留的测定,GCECD法测定氨基甲酸酯类农药残留与本节有机磷农残的气相色谱测定方法相同，详见GBT 173311998。,四、拟除虫菊酯类农药残留及其检测,(一)拟除虫菊酯的特性及常用品种拟除虫菊酯(Pyrethroids)是近年来发展较快的一类重要的合成杀虫剂。拟除虫菊酯分子较大，亲脂性强，可溶于多种有机溶剂，在水中的溶解度小，在酸性条件下稳定，在碱性条件下易分解。,拟除虫菊酯具有高效、广谱、低毒和生物降解等特性，拟

19、除虫菊酯和除虫菊酯杀虫剂在光和土壤微生物的作用下易转变成极性化合物，不易造成污染。拟除虫菊酯在化学结构上具有的共同特点之一是分子结构中含有数个不对称碳原子，因而包含多个光学和立体异构体。这些异构体又具有不同的生物活性，即使同一种拟除虫菊酯，总酯含量相同，若包含的异构体的比例不同，杀虫效果也大不相同。,常见的拟除虫菊酯有：烯丙菊酯(Allethrin)、胺菊酯(Tetramethrin)、醚菊酯(Ethofenprox)、苯醚菊酯(Phenothrin)、甲醚菊酯(Methothrin)氯菊酯(Permethrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(Dehamethrin)、氰菊

20、酯(Fenpropanate)、杀螟菊酯(Phencyclate)、氰戊菊酯(Fenvalerate)、氟氰菊酯(Flucythrin)、氟胺氰菊酯(Fluvalinate)、氟氰戊菊酯(Flucythtinge)、溴氟菊酯(Bmthrinate)等。,目前，已合成的菊酯数以万计，迄今已商品化的拟除虫菊酯有近40个品种，在全世界的杀虫剂销售额中占20左右。拟除虫菊酯主要应用在农业上，如防治棉花、蔬菜和果树的食叶和食果害虫，特别是在有机磷、氨基甲酸酯出现抗药性的情况下，其优点更为明显。除此之外，拟除虫菊酯还作为家庭用杀虫剂被广泛应用，它可防治蚊蝇、蟑螂及牲畜寄生虫等。(二)拟除虫菊酯残留的检测

21、参考本节中有机氯农药残留的检测，详见GBT 173321998。,第四节 食品中霉菌毒素及其检测 一、霉菌毒素的种类 霉菌是一些丝状真菌的通称，在自然界分布很广，几乎无处不有，主要生长在不通风、阴暗、潮湿和温度较高的环境中。霉菌可非常容易地生长在各种食品上并产生危害性很强的霉菌毒素。目前已知的霉菌毒素约有200余种，与食品关系较为密切的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素等。已知有5种毒素可引起动物致癌，它们是黄曲霉毒素(B、G、M，)、黄天精、环氯素、杂色曲霉素和展青霉素。,霉菌污染食品可使食品的食用价值降低，甚至使之完全不能食用，造成巨大的经济损失。据统计全世界每年平均有2的谷物由于霉变不

22、能食用。霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食、油料作物以及发酵食品等引起。霉菌毒素多数有较强的耐热性，一般的烹调加热方法不能使其破坏。当人体摄入的霉菌毒素量达到一定程度后，可引起中毒。霉菌中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等。,二、黄曲霉毒素,黄曲霉毒素(Aflatoxins。简写AFT)是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒菌株的代谢产物，是一群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素。根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类：B大类在氧化铝薄层板上于紫外光照射下呈现蓝色荧光；G大类则呈绿色荧光。

23、,AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严重，此外各种植物性与动物性食品也能被广泛污染，如在胡桃、杏仁、高梁、小麦、豆类、王豆、皮蛋、奶与奶制品、干咸鱼及辣椒中均有AFT污染。其污染程度与各种作物生物学特性和化学组成以及成熟期所处的气候条件有很大关系。一般来说，富含脂肪的粮食易产生AFT。此外，收获季节高温、高湿，也易造成AFT的污染。,AFT属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFT Bl的毒性和致癌性最强，故其在食品中允许量各国都有严格规定。FAOWHO规定食品中 AFTBl15 ppb，美国20 ppb，日本10 ppb，以色列与

24、瑞典规定不得检出。,（一）黄曲霉毒素的结构与理化性质,1、黄曲霉毒素的结构,2、黄曲霉毒素的理化性质 1）溶解性：AFT的分子量为312346，中等极性化合物，难溶于水、乙醚、石油醚及己烷中，易溶于油和甲醇、丙酮、氯仿、苯 等有机溶剂中。2）稳定性：AFT是一组性质比较稳定的化合物；其对光、热、酸较稳定，而对碱和氧化剂则不稳定。,（二）霉菌毒素的检测我国涉及黄曲霉毒素的限量及检测的国家标准有GB 27611981(食品中黄曲霉毒素B1允许量标准)、GB 9676-1988(牛乳及其制品中黄曲霉毒索M，限量卫生标准)、GBT 17480-1998(酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素B、)、GBT

25、 500922-1996薄层色谱法(第一法)ELISA(第二法)测定食品中黄曲霉毒素B，GBT 5009231996薄层色谱法(第一法)微柱筛选法(第二法)测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,薄层色谱法测定食品中黄曲霉毒素M1、B1其最低检出量0.4 ng是各实验室所公认的。高效液相色谱法测定食品中AFT B1、B3、Gl、G 2、M1,GBT 5009241996,黄曲霉毒素的测定,薄层层析法测黄曲霉毒素 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准方

26、法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。,。,原理,本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。薄层色谱法黄曲霉毒素B1的最低检出量为0000 4ug，最低检出浓度为5ugKg。,仪器,小型粉碎机样筛电动振荡器玻璃浓缩器玻璃板5cm20cm、薄层板涂布器展开槽(25cm6cm4cm)紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2),试剂,三氯甲烷、正己烷(沸程3060)或石油醚(沸程6090)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱

27、水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。,吸附剂硅胶,薄层层析用硅胶有多种规格。应用最多的是掺有粘合剂石膏的硅胶，称有硅胶G，其掺入的石膏量为5-20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来，对层析的结果产生一定影响。硅胶H不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。硅胶HF254 掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。硅胶GF254含石膏及荧光物质。,黄曲霉毒素B1标准溶液,1、黄曲霉毒素B1标准贮备液：准确称取112mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4

28、保存。此标准液浓度约为10ugmL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确100ugmL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800.,2、黄曲霉毒素B标准使用液：I液(1.0ugmL)：取1mL AFTB标准液(10.0ugmL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。液(0.2ugmL)：取I液1mL，按上法定容5mL。液(0.04ugmL)：取液1mI。，按上法定容5mI。思考：在配制黄曲霉毒素B标准使用液时，为什么需要用贮备液来稀释而不是直接配制？,次氯酸钠溶液,配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。

29、另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25gL。思考题：1、次氯酸钠溶液的作用是什么？消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。2、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？,操作步骤,样品处理提取 浓缩薄板制备点样展开定量,(1)样品处理,样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至05lkg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。,(2)提取,称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的

30、快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。,取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。,浓缩,将蒸发皿放在通风柜，于65水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却23min后，准确加入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，再用此

31、滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中。注意：若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失。,测定单向展开法,1、薄板制备：称取3g硅胶G，加23倍量的水，研磨12min呈糊状后，倒人涂布器推成5cm20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在100活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存23d，若放置时间较长，可再活化后使用。,点样,将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸边加。

32、滴加样式如下：,第一点：10L AFTB，标准使用液(004gmL)。第二点：20L样液。第三点：20L样液+10L 0.04gmL AFTBl标准使用液。第四点：20L样液+10L 0.2gm L AFTB1标准使用液。,展开与观察,在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8：92)，展开1012cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：,a由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0000 4g，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性

33、；则起定性作用。薄层板上第四点AFTB1标准为0002ug主要起定位作用。,b若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTBl含量5ugkg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验。,确证试验,为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸（TFA），产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：10uL 004ugmL AFTBl标准使用液。第二点：20L样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40)，再于薄层板上滴加以下两点。第三点：10u

34、L 0.04ugmL AFTBl标准使用液。第四点：20L样液。,按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照。稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1。标准点最低检出量(0.00 04g)的荧光强度一致，则样品中AFTB1含量为即为5gkg,若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下：第一点：l0uL AFTB1，标准使用液(0.04ugmL)。第二点：根据情况滴加10uL样液

35、。第三点：根据情况滴加15uL样液。第四点：根据情况滴加20uL样液。,4)结果计算 X=式中：X 一 样品中AFTBl的含量，ugkg；V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL；V2出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；D一样液的总稀释倍数；m1加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g；0.0004AFTBl的最低检出限量，ug。,测定双向展开法,原理 如用单向展开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚做横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边，而AFTB1不动，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做纵向展开，样品在相应处的杂质底色大量减少，因而提

36、高了方法的灵敏度。,操作步骤,(1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上，在距左边缘081cm第二篇食品理化检测技术处，各滴加10uL AFTB1(0.04ugmL)标准液，在距左边缘2.83cm处，各滴加20uL样液。然后在第二块板的样液点上滴加l0uL AFTBl(0.04ugmL)标准液，在第三块板的样液点上滴加10uL AFTB1(0.02ugmL)标准液。,(2)展开：a横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l2次。b纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8

37、：92)展开至1012cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。,观察与评定结果,a在紫外光下观察第一、二块板，若第二块板在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTBl含量5ugkg.b若第一块板与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，这第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。在具体测定中，三块板可以同时做，也可按顺序做。当第一块板出现阴性时，第三块板可以省略，如第一块板为阳性，则第二块板可省略，直接做第三块。,确认试验,另取薄层板二块，于

38、第四、五两板距左边缘0.81cm处，各滴加10u LATTB1(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸；在距左边缘2.83cm处，于第四板滴加20uL样液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL样液、10uL。AFTBl(0.04ugmL)标准液及一小滴三氟乙酸，反应5min后，用热风吹2min(板上温度不高于40)。再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确认试验.,(5)稀释定量：若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。若AFTB

39、1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。3.2.3 结果计算 同单向展开法。3.2.4 说明及注意事项,由于AFT是一剧毒且强致癌性物质，使用时应特别小心应按以下规定进行实验操作和实验后的清洗消毒工作。实验时应戴口罩；配标准溶液时戴手术手套。若衣服被污染，须用5次氯酸钠溶液浸泡15 30分钟再用清水洗净。对于剩余的AFT标液或阳性样液，应先用5次氮酸钠处理后方可倒到指定的地方。,实验中所用的或被污染的玻璃器皿须经5次氯酸钠溶液浸泡5分钟再清洗之。不能用洗衣粉洗涤，因其中含荧光物质，可用肥皂水。实验完毕应用5次氯酸钠清洗消毒实验台等。万一手皮膜被污染，可用次氯酸纳溶液搓洗，再用肥皂水洗净。,(三）酶联免疫法测定原理：固相酶联免疫吸附。B1特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入样品提取液（未知抗原）及B1抗原（已知抗原），使两者与抗体进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标B1抗原结合的量，即样品中B1多，则被抗体结合的B1抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法或酶标仪B1标准样比较判断样品中B1的含量。仪器：黄曲霉毒素B1测定仪,