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1、第四章 核苷酸和核酸,核酸的发展和研究简史,1868 Friedrich Miescher 核素 1889 R.Altmann 核酸 1909 Levene、Jacobs 酵母核酸中的D-核糖 1929 Levene、Jacobs 胸腺中的D-2-脱氧核糖 1953 Watson、Crick DNA的双螺旋结构 1956 Konberg DNA聚合酶 1958 Crick 中心法则 1961 Jacob、Monod 操纵子学说 1966 Nirenberg 破译遗传密码 1970 Nathans 限制性内切酶 1981 Cech 核酶的发现 1990 启动人类基因组计划,Completion
2、of a working draft,June 26,2000.HGP leaders and President Clinton announce the completion of a working draft DNA sequence of the human genome.Biology entered a brave new era,the Age of Genomics.,2002年2月12日，历时年的人类基因组机会最终完成，报道了的人类基因组序列，从这时候起，生物学进入了后基因组时代（post genomic era)，人类基因的研究由测定DNA序列，解释遗传信息的传递转移到从
3、分子整体水平上对生物功能的研究，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘，包括蛋白质组学，功能基因组学，药物基因组学等。,2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁菲尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。,年诺贝尔化学奖授予美国科学家罗杰科恩伯格，以奖励他在“真核转录的分子基础”研究领域作出的贡献。2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国的马里奥-R-卡佩奇、奥利弗-史密斯和英国的马丁-J-伊文思，以奖励他们在胚胎干细胞和“基因打靶”研究方面所做的贡献。,核酸的种类及功能,单链DNA：某些病毒 DNA 环状双链DNA：质粒、细菌 线状双链DNA：真核生物 mRNA RNA t
4、RNA rRNA DNA 主要的遗传物质 RNA 参与蛋白质的生物合成,某些病毒的遗传物质,肺 炎 球 菌 转 化 实 验,碱基,嘧 啶,嘌呤,碱基、核苷和核苷酸,腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,尿嘧啶,核苷：核苷碱基戊糖,核糖脱氧核糖,碱基和戊糖的结合方式,H,H,H,H,嘌呤核苷,嘧啶核苷,核苷酸,嘌呤核苷酸,嘧啶核苷酸,核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,具有信号及调控作用的核苷酸,辅 酶 A,核苷酸参与构成的重要化合物,稀 有 碱 基,2-核苷酸和3-核苷酸的混合物,RNA在碱溶液中的水解,核酸的共价结构,文字式：pApCpGpT
5、pA pACGTA,碱基的性质：异构化,内酰胺,内酰亚胺,双内酰亚胺,DNA双螺旋中的碱基对氢键形式,核酸的紫外吸收 增色效应，减色效应,DNA 的 双 螺 旋 结 构,Rosalind Franklin,DNA 的X-射线衍射图,20世纪40年代后期，Erwin Chargaff通过对各生物碱基组成分析，提出了重要的Chargaff定则：(1)A=T(2)G=C(3)A+G=T+C,DNA双链的方向,双链DNA的俯视图,通过对碱基组成特点及DNA结晶的X光衍射分析,1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型。特点：(1)两条链反平行相互缠绕的右手螺旋，螺旋上有大沟(majo
6、r groove)和小沟(minor groove)。(2)碱基在内侧，磷酸和核糖在外侧。(3)螺旋直径2nm，相邻碱基距0.34nm，每圈10（10.5）对碱基，螺距3.4（3.6）nm。(4)A与T配对，形成2个氢键；G与C配对，形成3个氢键。(5)DNA双螺旋结构稳定的力主要是氢键（横向)和碱基堆积力（纵向）。,B-DNA,A-DNA,Z-DNA,三种双螺旋DNA类型的比较,特殊的DNA碱基顺序：回文顺序和镜像重复顺序,（回文顺序）,具有回文顺序的DNA可以形成“发夹”或“十字”形结构,具有镜像对称顺序的碱基易于形成三链DNA(H DNA),Hoogsteen 配对,RNA的结构,单链R
7、NA（rRNA）因为分子内部的碱基配对形成的二级结构，无配对的碱基形成“突起”或“环”。,3-end,5-end,16s rRNA的二级结构,tRNA的二级结构 和三级结构,tRNA的三叶草形二级结构,tRNA的倒L-形三级结构,mRNA的结构单顺反子mRNA（monocistronic mRNA）与多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）:原核生物的mRNA仅为一条肽链编码，称为单顺反子mRNA；为两条以上肽链编码则为多顺反子mRNA。,内含子(intron),真核生物mRNA成熟过程：,外显子(exon),核酸的变性、复性及杂交,核酸的变性,在某些理化因素作用下，DNA双链
8、解开成两条单链的过程称为变性。,变性后理化性质变化：OD260增高粘度下降浮力密度升高生物活性丧失等等,RNA和DNA的熔解温度曲线,DNA 的Tm值与G-C含量的关系,(G+C)%=(Tm-69.3)2.44,退火:变性的DNA经缓慢冷却后可复性，这一过程称为退火。淬火:热变性DNA溶液温度迅速降至0oC，DNA单链失去碰撞机会，不能复性，此种冷处理过程称为淬火。,不同来源的单链核酸依据分子的互补性形成双螺旋的过程称为分子杂交。利用分子杂交技术，可以用设计的DNA探针钓出特殊的DNA顺序或基因。,DNA 的杂交,核酸的复性：影响复性的因素：冷却的快慢，DNA的浓度，DNA的复杂程度 复性的快
9、慢以Cot1/2(K，分子的复杂度)来表示，表明DNA复性反应的初始浓度与反应完成一半所需时间的乘积是个常数。K随DNA分子量的增加而增大。,核酸的化学反应：碱基的脱氨基作用:碱基的环外氨基的丢失C:10-7/24A/G:10-9/24,2.核酸的脱嘌呤作用：10-/24,DNA 的突变紫外线的诱导,DNA 链上的胸腺嘧啶二聚体,化学诱变剂脱氨基试剂：亚硝酸类化合物烷化剂：SAM,二甲基硫酸酯等超氧化物：H2O2 等,DNA 的酶法甲基化SAM 介导的甲基化系统Dam甲基化酶介导的甲基化：5 GATC 3 DNA 的甲基化有调控基因表达的作用。,核酸的酶解 核糖核酸酶 专一性核酸酶 脱氧核糖核
10、酸酶 牛脾磷酸二酯酶 非专一性磷酸二酯酶 蛇毒磷酸二酯酶,RNase I,RNase T1,RNase T2,DNase I,DNase II,核酸外切酶：蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶核酸内切酶,a,b,核酸的限制性内切酶 1962年发现细菌中含有特异的核酸内切酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化而避免水解，而外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定。这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。,II 类限制性核酸内切酶特点：只由一条肽链构成，作用不需ATP，仅需Mg2
11、+，不进行甲基化或其他化学修饰；作用位点有4或6个核苷酸残基，作用位点具有回文结构，得到粘末端或平末端。,产生5突出粘性末端:以EcoR I为例：5GAATT C3 5Gp HOTTAAC33C ATAAG5 3CTTAAOH pG5 产生3突出的粘性末端：以Pst I为例：5CTGCAG3 5CTGCAp HOG33GACGTC5 3GOH pACGTC5 产生平末端：以Nru 为例：5TCGCGA3 5TCGp HOCGA33AGCGCT5 3AGCOH pGCT5,限制性酶切图谱：各种限制性内切酶在某一DNA分子或DNA片段上切点的排列，各酶切位点之间的距离以碱基对数目表示。也称物理图。
12、限制图的制作：对DNA链的一端进行放射性同位素标记单酶切琼脂糖凝胶电泳切点数各片段分子量双酶切琼脂糖凝胶电泳,DNA一级结构的测定：双脱氧末端终止法,DNA 的酶促合成条件：模板引物四种dNTPDNA聚合酶,Sanger末端终止法原理：把聚合反应分四组，每组加入一种2，3双脱氧核苷三磷酸。它随机地掺入到合成的DNA中，一旦掺入，DNA的合成就终止，所以加入有2，3双脱氧腺苷酸(ddATP)的那一组所有的片断均是以ddATP为3末端，其余类似。,双脱氧末端终止法,核酸自动测序仪的原理,DNA的超螺旋,正超螺旋：螺旋过份，即每圈螺旋的碱基对数目小于10.5;负超螺旋：螺旋不足,即每圈螺旋的碱基对数目大于10.5;,负超螺旋可以形成两种不同的状态,天然DNA都以负超螺旋的形式存在。负超螺旋易于形成“泡状”结构，有利于DNA的复制、重组和转录等功能。,超螺旋数：Lk Wr+Tw Wr：超螺旋数（Lk，螺旋轴的缠绕数）Lk：拓扑连系数（拓扑旋转数）Tw：螺旋数（Lk0,BDNA螺旋数）对一个含有210bp的环形闭合DNA分子，T210/10.5=20如果从中解开2个超螺旋，则Lk 18，超螺旋数Wr Lk T18-20=-2 超螺旋密度 2/20=-0.1 细胞中DNA 的超螺旋密度一般为-5%-7%.,
