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1、第五章核酸的分离与检测,一、核酸的分离、提取通则,核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。,1.细胞裂解,机械作用：低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸的分离。化学作用：一定p H 和变性条件下，细胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸水相。变性条件：加热、表面活性剂(SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40 等)、强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍等)。p H 环境：强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE 等)
2、。金属离子螯合剂(EDTA 等)螯合Mg2+、Ca2+，抑制核酸酶活性。酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。联合使用：细胞、待分离核酸类型及后续实验目。,2.酶处理,裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K 或链酶蛋白酶），降解蛋白质；灭活核酸酶（DNase 和RNase）加入DNase 和RNase 去除不需要的核酸。,防止核酸的降解和变性,防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏（一般在 pH 4-10下进行）;避免剧烈搅拌；防止核酸酶（DNase,RNase）的作用。,抑制DNase：可加柠檬酸钠、EDTA等金属螯合剂；或加去污剂十二烷
3、基硫酸钠（SDS）；或加蛋白变性剂。抑制RNase：实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用 具用0.1%二乙基焦碳酸盐（diethyl pyrocarbonate,DEPC）处理。加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。加核糖核酸酶阻抑蛋白（RNasin）等RNase的抑 制剂。,质粒DNA的提取碱裂解法,溶液I：50 mM葡萄糖，25，10 mM EDTA，pH 8.0 Tris-Cl pH；葡萄糖大肠杆菌悬浮；EDTA 金属离子螯合剂。溶液II：0.2 N NaOH，1%SDSNaOH 碱裂解细胞，控制时间，温柔混合；SDS 结合蛋白。溶液III：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸醋酸钾
4、PDS沉淀；醋酸 中和碱。,3.核酸的分离与纯化,高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。,酚提取/沉淀法,经典方法是酚:氯仿抽提法。裂解细胞；离心分离含核酸水相；等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1 体积)混合液抽提，漩涡振荡混匀(小分子量核酸)/颠倒混匀(高分子量核酸)，离心分离；疏水性的蛋白质有机相，核酸上层水相。缓冲液饱和酚蛋白变性；氯仿增加有机相比重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过程中产生的气泡，下层的界面更清晰。,核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩,酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀 水相加p H5.05.5，终浓
5、度0.3M NaAc 或KAc（钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷，在酸性环境中促进核酸疏水复性），加22.5 倍体积乙醇，沉淀核酸。离心收集，70%乙醇漂洗核酸沉淀除盐分。其他可用于沉淀核酸的有机溶剂：异丙醇、聚乙二醇(PEG)等；盐类：10.0mol/L 醋酸铵、8.0mol/L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等。,分离沉淀DNA,层析法,利用物质些理化性质差异建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。商品试剂盒，分离和纯化同步进行。一定离子环境下，核酸被选择性地吸附到硅土、硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。核酸质量好、产量高、成
6、本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化。,Promega 质粒纯化系统,以磁性颗粒为基础：采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒。以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，可用离心法进行纯化。以树脂为基础：利用树脂，真空法。DNA在高盐条件下对硅树脂、膜的高亲和力。,全自动核酸分离纯化系统,Roche MagNA Pure 96,MagNA Pure LC 2.0,二、核酸含量的测定,核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组成的核苷酸的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以只要测定三者中任何一处成分的含量，就可推算出核酸的含量。常用的核酸测定方法有：紫外吸收法、定磷法、定糖法RNA的定量测定：
7、地衣酚法DNA的定量测定：二苯胺法,紫外吸收法中DNA或RNA的定量,A260=1.0相当于:50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸,分光光度计,Biophotometer,Nanophotometer,Single and multi wavelength measurement combined with kinetic methods.The full wavelength scan(190 nm-1100 nm)allows curve interpretation for attainment of more detailed scientifi
8、c knowledge over whole spectrum.sample size as low as 0.5uL.,Thermo Scientific NanoDrop 2000c(March 2,2009),Thermo Scientific NanoDrop 2000 and 2000c Spectrophotometers.These easy-to-use,UV-Vis instruments enable a 5-second measurement time of DNA,RNA and proteins on a sample size as low as 0.5uL.,核
9、酸纯度鉴定,A260/A280DNA纯品:A260/A280=1.8RNA纯品:A260/A280=2.0电泳,核酸的凝胶电泳,当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸的分子量、纯度、结构变化、序列分析等 种类：琼脂糖凝胶电泳（水平电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直电泳，分辨率可达1bp常用于测序）,核酸样品的保存,DNA：DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。RNA：RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物
10、)冻贮于-70,可保存数年。,三、核酸的检测,PCR：常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR杂交：膜杂交（Southern Blot、Northen Blot）、组织样品原位杂交,1.荧光定量PCR（real time PCR）,1996，美国Applied biosystems公司推出：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确。,与常规PCR的区别
11、,常规PCR：PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。,两个重要概念,荧光域值（threshold）：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线荧光信号的标准偏差的 10 倍。Ct值（Cycles threshold）：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。,荧光定量PCR化学原理,非特异性荧光标记：SYBR Green 特异性荧光标记：TaqMan,SYBRGreenI荧光染料的作用原理,SYBR Green I
12、：结合于双链 DNA小沟。PCR 反应体系中，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号。优点：与所有双链 DNA 结合，不必因为模板不同而特别定制通用性；价格相对较低；一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，灵敏度很高。缺点：能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合。需要熔解曲线分析。,SYBR Green 熔解曲线分析,TaqMan探针法,TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，设计为与目标序列上游和下游引物间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。当探针保持完整时，3端猝灭基团抑制5发
13、射基团的荧光发射。在PCR的退火期。探针模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，到达探针处，Taq酶有53外切核酸酶活性，切割探针，荧光发射基团远离猝灭基团，荧光信释放。随着扩增循环数的增加，荧光基团不断积累。即荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。,优点：特异性高、重复性好、阴性结果确定、引物设计相对简单公司网站缺点：只是用于一个靶基因，成本高。,定量方法,绝对定量：确定样品中某一核酸序列的拷贝数。相对定量：样品中某一核酸序列相对与对照样本中同一核酸序列的表达。,绝对定量,通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片
14、段的克隆质粒、含有和待测样品相同扩增片段的cDNA、PCR的产物,相对定量通过内标定量,内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因靶基因表达的相对量以靶基因相对其内标的CT表示：CT=靶基因CT-GAPDH CT 不同样本靶基因表达的差异以CT表示，由最高CT与其他各CT分别相减而得。靶基因表达的相对倍数以2-CT表示。,阶段 P311平均CT GAPDH平均 CT CT CTE14.5 23.650.29 16.490.07 7.160.25-0.65E16.5 23.010.49 16.590.25 6.420.24-1.39E18.5 24.
15、460.88 18.010.65 6.450.22-1.36P5 24.790.62 19.430.14 5.360.48-2.45P11 23.500.95 18.920.70 4.570.25-3.44P14 24.180.89 19.420.86 4.760.11-3.25P30 27.320.60 19.510.25 7.810.28 0,实时PCR显示P311在肺发育不同阶段的表达,小鼠肺发育不同阶段P311 mRNA的表达,Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪,ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪,2.核酸杂交,膜杂交 Southern Blot DNA North
16、ern Blot RNA Western Blot Protein组织切片杂交 In situ Hybridization DNA/RNA Immunohistochemistry Protein,主要杂交模式：,膜杂交,原理：核酸变性和复性杂交在持膜上进行核酸印迹杂交 分类：DNA印迹杂交（Southern blot）RNA印迹杂交（Northern blot）,核酸杂交的基本过程,制备样品待检测组织样品：动、植物器官、组织，培养细 胞，细菌，病毒等核酸：分离提取DNA（RNA）酶切：限制性内切酶消化DNA电泳：凝胶电泳分离酶切DNA混合物DNA变性：获得单链DNA转膜：将核酸样品转移到支持
17、膜上(硝酸纤维素膜、尼龙膜),限制性内切酶消化DNA,琼脂糖凝胶电泳,变性、转膜,制备探针,探针（probe）:互补于靶基因顺序的单链DNA或RNA片段，通常带有标记物如：放射性同位素、荧光化合物或半抗原地高辛等，以检测目的基因。,杂 交,杂 交 炉,杂交原理,漂洗、检测,检测结果,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,Southern Blot：基因的有无遗传病、感染性疾病等,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,电泳方向,限制性
18、片段长度多态性,菌落原位杂交筛选目地基因,斑点杂交,Northern Blot：基因表达的半定量分析,原位杂交,应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸进行杂交，再用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影、组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位的技术。,1）原位杂交的分类,根据所用探针和靶核酸的不同：DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交 根据探针的标记物是否直接被检测：直接法放射性同位素、荧光及某些酶标记 探针间接法半抗原标记探针，免疫组织化学法 对半抗原定位,DNA-DNA杂交,灵敏
19、度较低。主要用于外源性基因检测（病毒的检测）。杂交时需先在高温 80-95短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅速置于冰上冷却。然后置于3742杂交过夜。,宫颈息肉 HPV DNA探针原位杂交,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交,DNA-RNA杂交,灵敏度高（cDNA中无内含子、高度重复序列；无靶基因自身复性）cDNA探针制备困难,RNA-RNA杂交,避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题 cRNA-RNA杂交体较DNA-DNA、cDNA-RNA稳定，在杂交后可用RNA酶除去未结合的探针，因此特异性更强。灵敏度较高 RNA原位杂
20、交检测和分析的主要为内源性基,E18.5lung-VEGF,2）RNA原位核酸杂交方法,DNA-RNA杂交 RNA-RNA杂交,原位杂交技术的基本方法,杂交前准备：取材、固定、玻片和组织切片处理（增强探针的穿透性、减低背景染色、RNase等）杂交：一定温度下，探针与靶RNA的结合杂交后处理：去除未杂交探针显示：放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学反应显示杂交结果,取材,新鲜组织、细胞；尽快冷冻或固定杂交前所有用具RNase free,固定,目的：保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内RNA水平；使探针易于进入细胞或组织。最常用多聚甲醛（4%）固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉
21、连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。醋酸、酒精的混合液和Bouins固定剂,包埋、切片,石蜡切片：固定组织用PBS冲洗后，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。冰冻切片：组织固定后，30%蔗糖处理过夜，OCT包埋、切片，-80 保存备用。,OCT-optimum cutting temperature compound,聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。漂片时可溶于水，不增加背景染色。,全自动脱水机（Tissue Prosessing）,石蜡组织包埋机（Embedding）,包埋用具,包埋后的组织蜡块,石蜡切片机（Microtome）
22、,展片机,冰冻切片机（Cyrostat）,探针的制备,特异性cDNA探针：制备困难cRNA探针：以cDNA为模板，体外转录获得，单链探针，cRNARNA杂交体稳定；RNase敏感 人工合成寡核苷酸探针：DNA合成仪合成，不需要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长错配，过短特异性差 探针长度：500碱基,探针标记方法,末端标记法：将标记物导入线型 RNA的5端或3端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带的标记分子较少。体外转录法：模板线性化质粒DNA/PCR产物（含T7、T3或SP6启动子），RNA聚合酶，NTP（一种标记带标记）所有的RNA就被标记。,末端标记法,碱性磷酸酶,T4多聚核苷酸激
23、酶,T4 多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将 ATP 的 g-磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。,体外转录基因克隆载体,体外转录标记,标记物,同位素 非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素 直接标记、间接标记,地高辛标记技术,Digoxigenin（DIG），源于从洋地黄类植物中提取的类固醇。洋地黄花和叶片为Digoxigenin在自然界中的唯一来源，抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，高特异性。灵敏度高。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦。,地高辛的结构,Structure of
24、 Alkali-liable Digoxigenin(DIG)-dUTP,AP（碱性磷酸酶）标记抗-DIG抗体检测,碱性磷酸酶显色试剂,BCIP/NBTBCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐NBT(四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一。在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化合物。,相关设备,杂交炉,杂交,脱蜡：二甲苯脱蜡，逐级梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗，蒸馏水洗。固定通透：蛋白酶（蛋白酶K/proteinase K，链霉蛋白酶/pronase和胃蛋白酶/pepsin)消化包围靶RNA的蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号。过度消化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导致标本从载玻片上的脱落。再固定,酸酐处理：防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景 脱水预杂交：阻断玻片和标本与探针的非特异性结合减低背景杂交：探针变性，过夜，温度、湿度洗涤：SSC缓冲液洗除未杂交探针显色：抗体（anti-dig-ap碱性磷酸酶）孵育，底物显色；复燃（苏木精、快绿）脱水、封片,
