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1、第 二 章核 酸CHEMISTRY OF NUCLEIC ACID,核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学的重要基础之一。,核酸概述（一）核酸的发展史 1.1869年,瑞士年轻的医生Friedrich Miescher 在废弃的外科绷带上的血细胞核中分离到一种物质，含有高比例的磷，他将其命名为“核素”（nuclein）。后来，发现有强烈的酸性，改名为“核酸”（nuclei
2、c acid）。虽然Miescher并不知道，但他发现了DNA！,2.不久，Hoppe-Seyler 从酵母细胞中分离了类似的物质，现在知道是RNA。3.20世纪50年代以前，“四核苷酸假说”比较流行，但缺乏结构方面的多样性，因此普遍认为核酸不大可能有重要的生理功能。4.1943年，Chargaff等证明DNA中4种碱基的比例并不相等。5.1944年，美国生化学家Avery通过肺炎双球菌转化实验，证实DNA是遗传物质。,6.1953年,James Watson and Francis Crick提出了DNA的双螺旋结构模型。,（二）核酸概念 和蛋白质一样，核酸是一种重要的生物高分子化合物，是由
3、其结构单体核苷酸通过3,5-磷酸二酯键聚合而成的长链，继而形成具有复杂三维结构的大分子化合物。核酸是动物、植物、微生物机体的重要组成成分，约占细胞干重的。,（三）核酸分类和分布 1.核酸的分类 根据核酸的化学组成，分为两类:核糖核酸（ribonucleic acid 简写为：RNA）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid 简写为：DNA）,2.核酸的主要分布 DNA：主要分布在真核细胞的细胞核中，在线粒体、叶绿体等细胞器中也含有较少的DNA。原核细胞则分布在其拟核区。RNA：主要分布在真核细胞的细胞质中，核糖体上含量最多。细胞核的核仁区域进行旺盛的RNA合成（占RNA总量的1
4、0%）。目前发现每种病毒中只含其中一类核酸，因此共有两类病毒：DNA病毒（DNA virus）RNA病毒（RNA virus）,（四）核酸的重要性 1.DNA是主要遗传物质，是遗传信息的载体。证据有：细菌转化实验。1944年Avery 第一次证明了DNA是细菌转化的因子。噬菌体侵染细菌实验。1952 年，Hershey 和Chase 噬菌体感染实验。2.RNA在蛋白质生物合成中起重要作用。,肺炎球菌转化实验,噬菌体侵染细菌实验,一、核酸的化学组成 核酸的元素组成:C、H、O、N、P 其中P在各种核酸中的含量比较恒定：RNA平均含磷量8.9%DNA平均含磷量9.1%,核酸的逐级水解过程：核酸酶；
5、核苷酸酶；核苷酶,（一）戊糖（pentose）RNA中的戊糖为-D-核糖（-D-ribose）DNA中的戊糖为-D-2-脱氧核糖(-D-2-deoxyribose),2,1,3,4,5,2,（二）含氮碱基（氮碱）核酸中的碱基分为两类，即嘌呤碱和嘧啶碱。两类核酸中所含的主要碱基都是4种：1.嘌呤碱（purine）为嘌呤的衍生物，两种：腺嘌呤（adenine Ade or A）鸟嘌呤（guanine Gua or G）,嘌呤环,腺嘌呤,鸟嘌呤,N9是成苷位置,2.嘧啶碱（pyrimidine）胞嘧啶（cytosine Cyt or C）尿嘧啶（uracil Ura or U）胸腺嘧啶（thymin
6、e Thy or T）RNA中的碱基为胞嘧啶和尿嘧啶；DNA中的碱基为胞嘧啶和胸腺嘧啶。,N1是成苷位置,1,2,3,4,5,6,pyrimidine ring system 嘧啶环,胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶,3.稀有碱基（修饰碱基、微量碱基）含量甚少的碱基，多数为主要碱基的修饰物。tRNA中大约有10%。,4.碱基的结构特征（1）结构互变,酮式 烯醇式氨基 亚氨基,（2）嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）,（三）核苷（nucleoside）核苷是戊糖和碱基通过糖苷键形成的糖苷。由戊糖（核糖或脱氧核糖）的第1位C碳原子与嘌呤碱的第9位N原子或嘧啶碱的第1
7、位N原子通过N-糖苷键相连。核苷为-型，碱基平面与戊糖平面互相垂直。,核苷有两类，分别存在于RNA和DNA中：核糖核苷（ribonucleoside）脱氧核糖核苷（deoxyribonucleoside）,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,There are two types nucleoside,Proteins,nucleoside,Deoxynucleoside,核酸中的稀有核苷：次黄苷（inosine,I）假尿苷(pseudouridine,)7-甲基鸟苷（7-methylguanosine,m7G）二氢尿嘧啶核苷（dihydrouridine
8、,DHU）,（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸是核苷的磷酸酯。在核苷酸的核糖上，有3个游离的羟基，它们磷酸化可形成2-、3-和5-核苷酸。在脱氧核苷酸核糖上，有2个游离羟基，磷酸化形成3-和5-脱氧核苷酸。生物体游离核苷酸多为5-核苷酸。水解核酸得到5-核苷酸和3-核苷酸。,OH,H,腺嘌呤核苷酸（AMP）Adenosine monophosphate,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosine monophosphate,RNA中的核苷酸有4种：腺嘌呤核糖核苷一磷酸（腺苷一磷酸、腺苷酸）（adenosine monophosphate AMP）鸟嘌呤核糖核苷一磷酸（鸟苷
9、一磷酸、鸟苷酸）（guanosine monophosphate GMP）胞嘧啶核糖核苷一磷酸（胞苷一磷酸、胞苷酸）（cytidine monophosphate CMP）尿嘧啶核糖核苷一磷酸（尿苷一磷酸、尿苷酸）（uridine monophosphate UMP）,AMP,GMP,UMP,CMP,DNA中的脱氧核苷酸有4种：腺嘌呤脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧腺苷酸）（deoxyadenosine monophosphate dAMP）鸟嘌呤脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧鸟苷酸）（deoxyguanosine monophosphate dGMP）胞嘧啶脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧胞苷酸）（deoxycy
10、tidine monophosphate dCMP）胸腺嘧啶脱氧核糖核苷一磷酸（脱氧胸苷酸）（deoxythymidine monophosphate dTMP）,dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,（五）重要的其他核苷酸衍生物 1.多磷酸核苷酸 各种核苷一磷酸（NMP）继续磷酸化可生成为核苷二磷酸（NDP）和核苷三磷酸（NTP）例如：AMP（adenosine monophosphate）ADP（adenosine diphosphate）ATP（adenosine triphosphate）,AMP,ADP,ATP,2.环化核苷酸,环腺苷酸（cyclic AMP cAMP）环鸟苷酸（c
11、yclic GMP cGMP）它们作为细胞之间传递信息的信使。,N,cAMP,cGMP,二、核酸的一级结构,指核苷酸残基沿多核苷酸链的排列次序。实验证明，DNA和RNA是没有分支的多核苷酸链。1.连接方式：3,5-磷酸二酯键 2.确定：3-末端和5-末端 3.核酸的一级结构：各种不同的核苷酸在多核苷酸链上的排列顺序。,5-末端磷酸,3-末端羟基,3，5-磷酸二酯键,4.核酸一级结构的表达方式：（1）化学结构式：繁琐、复杂。（2）简写式 pApCpGpUpC p表示为磷酸基团，p在碱基的左侧表示与戊糖的5-OH结合，右侧表示与戊糖的3-OH结合。读向：左 右 碱基序列：5 3,T C A T G
12、 A,5P P P P P P OH 3,5pTpCpApTpGpA-OH 3,5TCATGA 3,（3）竖线式,三、DNA的二级结构双螺旋结构,（一）双螺旋结构的主要依据 1.DNA碱基组成的Chargaff规则 组成的四种碱基：A、G、C、T 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，A=T 鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等，C=G 嘌呤碱基总数=嘧啶碱基总数 即：A+G=C+T DNA的碱基组成有物种的特异性，不同物种的DNA有其独特的碱基组成。同一物种不同组织、器官有相同DNA碱基组成，不受生长发育、营养状况及环境影响。,不同生物来源的DNA四种碱基比例关系,2.X-光衍射数据 1938年，Astbur
13、y等用小牛胸腺DNA纤维做X-射线衍射分析，发现有0.34nm的周期变化。以后Franklin和Wilkins对DNA的X-衍射进行了更多的研究，获得清晰的衍射图谱。说明DNA是由2条或2条以上的多核苷酸链组成，沿长轴有0.34nm和3.4nm两个重要的周期性变化。,DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射图谱Franklin,（3）DNA的滴定曲线 DNA分子中的磷酸基可被滴定，碱基的可解离基团不能被滴定。1953年，J.Watson和F.Crick 在前人研究工作基础上，根据DNA结晶X-衍射图谱，提出了著名的DNA双螺旋结构模型（The double helical model of D
14、NA structure），并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测，这是20世纪生物科学最伟大的成就。因此而获得了诺贝尔奖。,（二）双螺旋结构模型（B-DNA）要点 1.DNA分子由两条反向平行的多核苷 酸链（一条链5 3,另一条链3 5）沿同一中心轴右手盘绕而成。磷酸与脱氧核糖通过 3,5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的主链骨架。两条主链是由磷酸-脱氧核糖交替而成，位于双螺旋外侧，侧链（碱基）位于双螺旋内侧。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行.2.两条链之间存在碱基互补的关系。即：A和T配对，中间形成两个氢键；C和G配对，中间形成三个氢键。,5,3,3.螺旋直径2nm，相邻碱基平
15、面垂直距离0.34nm,螺旋结构每隔10个碱基对（base pair,bp）重复一次，间隔为3.4nm。4.双螺旋的表面含有明显的大沟和小沟，其宽度分别为2.2nm和1.2nm，其碱基对暴露在外，与其他调节分子相互作用。,5.双螺旋结构的稳定因素（1）互补碱基之间氢键 主要决定碱基配对的特异性，而对双螺旋稳定的贡献不是最重要的。（2）碱基堆积力 包括疏水作用和范德华力。为螺旋稳定的主要作用力。（3）溶液中的阳离子或带正电荷的化合物对DNA表面磷酸基团的中和，消除了静电斥力。,（三）DNA二级结构的构象类型 DNA在不同盐溶液及不同相对湿度下可以各种不同状态存在：（1）B-DNA 相对湿度92%
16、的钠盐，典型的Watson-Crick双螺旋DNA，右手双螺旋，每圈螺旋10.4个bp，螺距：3.32nm。（2）A-DNA 相对湿度75%钠盐，右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。（3）Z-DNA 1979年Rich等发现。GC交替的寡聚体，左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,A-DNA B-DNA Z-DNA,（四）DNA双螺旋结构模型的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的
17、重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。,四、DNA的高级结构 DNA在双螺旋结构基础上通过扭曲和折叠所形成构象。超螺旋是三级结构主要形式。,（一）双链环状DNA分子（dcDNA）,存在于某些细菌的染色体、质粒、病毒、真核生物的线粒体和叶绿体中。在共价闭环双螺旋基础上进一步扭转盘曲,形成超螺旋(supercoil)体积进一步压缩。,拓扑连环数（linking number）L：一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数。扭转数（twisting number）T：B-DNA模型双螺旋数。超螺旋数（writhing number）W L=T+W W=0 松弛环 W 0
18、 正超螺旋（左手扭曲）,（二）双链线性DNA（dsDNA）分子 存在于真核生物的染色质和一些病毒中。,五、DNA和基因组 本部分为自学内容。,六、RNA的结构和功能 组成RNA的戊糖是核糖，主要碱基：A、U、G、C，U替代DNA中的T，还常有一些稀有碱基。RNA的结构单位主要是四种核苷酸：AMP、GMP、CMP、UMP。核苷酸连接方式：3,5-磷酸二酯键。天然RNA分子都是单链线形分子（有些病毒是双链），可自身回折，形成局部双螺旋（A-型，AU、GC），RNA中约40%-70%的核苷酸参与螺旋的形成。稳定性较差，易水解。,（一）tRNA（transfer RNA）1.tRNA概况：（1）含量：
19、占细胞内RNA总量的15%。（2）种类：50-60种，真核可达100多种（同工tRNA：运载同一氨基酸的几种tRNA）。（3）分子量：23-28kD，4S。（4）功能：专一携带氨基酸，是氨基酸运载工具。有些tRNA可作为反转录酶的引物，参与DNA的合成。,2.tRNA一级结构（1）组成：70-90个核苷酸（标准：76nt）。（2）不变和半不变的核苷酸：约有20多种。半不变的核苷酸主要是嘌呤或嘧啶间的互换的核苷酸。（3）TCG序列：54-57位，与 5S rRNA结合并与 tRNA 空间结构有关。（4）修饰碱基（修饰核苷酸）：转录后加工而形成，2-19个，70多种，占10%。,3.tRNA的二级
20、结构 tRNA的二级结构都呈“三叶草”形状，一般可将其分为四臂四环：,四环,二氢尿嘧啶环：8-12nt,反密码环：7nt,TC环:7nt,额外环4-5nt 可变,四臂,氨基酸臂：7bp 3-CCA,二氢尿嘧啶臂：D臂 3bp,反密码臂：5bp,TC臂：5bp,酵母tRNA Ala 的二级结构,3,5,TC环,4.tRNA的三级结构,倒“L”形，是所有tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似三级结构，这有利于携带的氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。,（二）mRNA（messenger RNA）概念：1961年Jacob和Monod提出用信使RNA命名。是带有从DNA上的到信息并指导蛋白质合成
21、的一类RNA分子，称信使RNA。含量：3-5%平均分子量50万，8S。功能：蛋白质合成模板（遗传密码）。hnRNA：真核生物RNA前体，需剪接、加工后为成熟的mRNA。,（三）rRNA（ribosomal RNA）占RNA总量的80，与蛋白质结合组成核糖体，是生物体内蛋白质合成的场所。种类：细菌有16S、5S、23S三种，组成30S的转录单位。真核生物有18S、5.8S、28S和5S四种，前3种组成45S的转录单位，5S rRNA单独转录。rRNA的二级结构：茎环结构,大肠杆菌 5S rRNA 结构,七、核酸的理化性质 核酸的结构特点：分子大，有一些可解离的基团，具有共轭双键等。（一）一般理化
22、性质 1.两性电解质。含有磷酸基和碱基，但表现为酸性。2.RNA纯品是白色的粉末，DNA为疏松的石棉一样的纤维状固体。3.线性大分子，极不对称，具有粘度高，抗剪切力差等特点。,3.溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，但其钠盐易溶于水。4.RNA的磷酸二酯键对碱敏感，室温下，被稀碱水解为2-或3-核苷酸。DNA在碱中虽变性，但不被水解，所以DNA更稳定。5.鉴别DNA和RNA的反应：RNA：D-核糖+浓盐酸+苔黑酚 绿色DNA：D-2-脱氧核糖+酸+二苯胺 蓝紫色,（二）核酸的紫外吸收 1.核酸中的碱基有共轭双键体系，有独特的紫外线吸收光谱，
23、其吸收峰240-290nm，最大吸收峰260nm。,2.天然核酸比其各核苷酸成分的光吸收值之和少30-40%（如图）。,1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸收值,（三）核酸的变性、复性与分子杂交 1.核酸的变性（1）变性（denaturation）的概念 某些理化因素使核酸分子互补双链之间的氢键断裂，使双螺旋变成松散单链的过程。,（2）变性因素 热变性：80几分钟，螺旋线团 酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）（3）变性表征 黏度下降、比旋光度下降、沉降系数增加、浮力密度增大、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失。增色效应（hyperchromic effect）：变性
24、后的核酸紫外吸收值增加的现象。,（4）热变性和Tm DNA的热变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。Tm：即解链温度或熔解温度（melting temperature），指核酸加热变性过程中，A260紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度。在Tm时，DNA内50%的双链结构被解开。DNA的Tm一般在82-95之间。,DNA的热变性曲线,影响Tm值大小因素 核酸均一性：均一性高，变性温度范围越窄。G-C含量与Tm值成正比。经验公式：Tm=69.3+0.41(G+C)%,介质离子强度：离子强度低，Tm低；离子强度高，Tm高。,pH：影响碱基的解离。高pH下，碱基失去质子，影响碱基对之间
25、氢键的形成，Tm下降。变性剂：尿素、甲醛等破坏氢键，Tm下降。,2.核酸的复性（1）复性（renaturation）的概念 又称退火（annealing），指变性DNA在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重新恢复天然的双螺旋构象。,The denaturation and renaturation of double-stranded DNA,（2）减色效应（hypochromic effect）复性使紫外吸收降低的现象。（3）复性条件 温度 缓慢冷却可复性。快速冷却称淬火（quenching），不能复性。DNA浓度：浓度较高，复性较快。DNA片段大小：片段越大，复性越慢。（4）
26、复性速度：复性速度可用 Co t 衡量，Co 为变性DNA原始浓度molL-1，t 为时间，以秒表示。,不同DNA的复性动力学曲线。,3.分子杂交（1）分子杂交的概念 不同来源DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对区域，复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）（2）分子探针（probe）带有某种标记物的已知序列的RNA或DNA片段。制备特定的探针通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。,（3）分子杂交实例 Southern Blotting 可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。基本步骤是：,DNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影,Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。Western Blotting 抗原与抗体的杂交，研究克隆基因表达产物，鉴定克隆株的常用技术。,八、核酸的序列测定 双脱氧终止法 英国Sanger于1955年确定牛胰岛素一级结构，1958年获诺贝尔化学奖。1975年设计出DNA测序法，1980年获诺贝尔化学奖。,
