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1、核酸物质提取与电泳,天然DNA的制备,一般地说。总DNA主要是指基因组DNA(genomic DNA)，即细胞核内的染色体DNA分子。核DNA分子呈极不对称的线状结构一条染色体为一个DNA分子。高等植物核DNA大约含有106 bp,其长度与直径的比例极不对称使其对机械力十分敏感。虽然目前可以成功地测定出它的一级结构。但仍难以分离出它的完整分子。,1.天然DNA的来源(1)染色体DNA(2)病毒与噬菌体(3)质粒DNA(4)线粒体与叶绿体,2.DNA的提取,细胞的破碎破碎的手段：物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法:容易导致DNA链的断裂.对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶K，在酶的
2、存在下共同破碎细胞。,超生波,液氮,总DNA的提取方法：去除多糖、脂类、蛋白等，得到的就是核酸,去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等去除脂类：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶、酚氯仿等,DNARNA,质粒DNA的提取,破坏细胞壁 溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS),裂解细胞膜 十二烷基磺酸钠(SDS)、Triton X-100,蛋白质及其它杂质的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来高浓度盐离子(KCl)使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来,细菌线形染色体DNA的去除强热、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，
3、与其它杂质缠绕而沉淀出来质粒DNA双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。,3.DNA的浓缩,(1)乙醇(2)异丙醇(3)聚乙二醇(PEG600),工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,RNA的提取分离,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,异硫氰酸胍/苯酚法,步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸
4、等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,RNA提取的通用方法,影响RNA提取的因素,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70短期保存,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母
5、和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组
6、织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,RNA降解,冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,OD260/OD280 比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残
7、留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260/OD280 比值偏低,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,电泳带型异常,非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和
8、18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,RT常见问题分析和解决方案,问题一：少量或没有RT-PCR产物,可能原因,解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNase处理R
9、NA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,RT常见问题分析和解决方案,问题三：产生弥散（smear）条带,第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染,可能原因,解决方案,RT常见问题分析和解决方案,4、DNA鉴定,DNA的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定,浓度鉴定,1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只
10、用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）,各种碱基的紫外吸收光谱,2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）,EB与DNA的结合,500l全血提取的基因组DNA电泳,动物组织提取基因组DNA,纯度鉴定,紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。A260与A280之比应在1.80；纯的RNA
11、 A260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。,完整性鉴定,凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。,核酸电泳,1.应与进行普通微生物实验的区域分离好2.使用标有“无RNA酶”的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶 3.双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时.
12、然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活 4.分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理,前期准备:,1.在Trizol试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放内含RNA，Trizol试剂对RNA有保护作用，能抑制RNA酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。2.将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和DNA，离心后取出上清液，里面含有RNA，而杂志留在苯酚中。3.在上清液中加入等体积异丙酮，混匀后，静置片刻，离心，将RNA沉淀于管底。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，将沉淀在真空干燥器中烘干。,核酸电泳,带电物质在电
13、场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定pH条件下可以解离成带电荷的离子。在电场中会向相反的电极移动。人们采用各种材料作为支持电泳介质创造出许多新方法其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。,自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段,凝胶电泳的原理：当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也
14、就是说电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快。反之则较慢。电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等,降低了对流运动故已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异。以及所带的净电荷的多寡。便可以通过电泳将蛋白质或核园分子混合初中的各种成分被此分离开来。,1.琼脂糖凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.脉冲电泳凝胶电泳,琼脂糖 是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质琼脂糖由1,3连接的吡喃型
15、-D-半乳糖与1,4连接的3,6脱水吡喃型-L-半乳糖组成。琼脂糖分子呈随机线团状，凝结初期由于氢键的作用形成双链分子，而后再发生双链分子间的连接直至最后固化。由于链间的连接是靠氢键的作用，所以一切会破坏氢键形成的因素都会影响凝胶的形成。,1.琼脂糖凝胶电泳,根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.,凝胶的分辨能力凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小浓度越高，孔隙越小其分辨能力也就越强：浓度降低孔隙就增大其分辨力也就随之减弱。凝胶的分辨能力同凝胶的类型
16、和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为70bp-80kb之间；而要分辨较小分子旦的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨能力为6-1000bp之间。,电泳时DNA迁移的影响因素1.DNA分子质量的影响2.DNA构型的影响 如：质粒 超螺旋DNA线状DNA开环DNA3.胶浓度的影响4.电场强度的影响5.EB的影响6.电泳缓冲液的影响7.碱基组成与电泳温度的影响,EP,电泳缓冲液 1.TAE(Tris-乙酸)2.TBE(Tris-硼酸)3.TPE(Tris-磷酸),TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀.TBE会引起高电渗现
17、象。TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.,电泳电压 一般电压为1-10V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm以下。电泳过程最好 在低温条件下进行。,琼脂糖电泳的用途,判断扩增片断的大小回收扩增片断用于转印进行Southern印迹,问题如何获得清晰的琼脂糖电泳照片呢？,琼脂糖电泳结果的影响因素,凝胶电泳液电压检测手段,琼脂糖凝胶浓度的选择,1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比。2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过20kb。
18、3、不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度/%0.30.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1,电泳缓冲液,DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。,电泳缓冲液比较,琼脂糖凝胶中DNA的检测,凝胶中核酸染色方法：溴化乙锭(EB)染色法和SY
19、BR Gold染色法 前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用 后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min,电压,琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。随着电
20、压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳,凝胶制备的注意事项,1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜）2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长3、EB含量要适当4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化5、检查梳子6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度7、凝胶稍厚些，避免样品溢出,电泳时间,PCR产物，应该在24h之内电泳电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方
21、向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难,电泳上样量,中号梳子：810ul小号梳子：68ul上样注意事项：1、加样时应悬空 2、加样尽可能快 3、不必每一个样品用一个吸头 4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯月亮”,凝胶拍照,曝光时间：6-10s拍照尺寸的选取：选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片一般拍摄两次才可以得到清晰的照片,小结,电泳图片的影响因素：凝胶，电泳液，EB，上样操作，拍照好的电泳图片不一定一次就可以获得,2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）,聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低
22、分子量蛋白质(低于100道尔顿)、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离。,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N-亚甲双丙烯酰胺(甲叉双丙烯酰胺)参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.,注意：丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺都具有神经毒性，能够经过皮肤及呼吸道进入体内，会因多次积蓄而中毒；故操作时要极其小心，需戴手套各面罩。,虽然聚丙烯酰胺凝胶的灌制比琼脂糖凝胶繁锁，但以下几
23、种优点是琼脂糖凝胶所不具备的：1.分辨率极高；2.比琼脂精凝胶的载样量大；3.回收的DNA样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验，如转基因动 物实验；4.在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中，带有酰胺侧链的C-C聚合物 不带或少带离子侧链基因；5.聚丙烯酰胺凝胶无色透明。比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低、抗腐蚀性 强、机械强度高、韧性好。,根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚 丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角.3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.加入TEMED
24、后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板 上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合 的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.1
25、0.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻 璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，1530min后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.,同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围（表3）,*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).,DNA染色:a.溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)在凝放电泳中，加入溴化乙锭染料对核酸分子染色之后(凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/m
26、l的EB)。将电泳标本放置在紫外光下观察便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA也可以被清晰地段现出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料可以插入列DNA或RNA分子的碱基之间。并在302nm波长的紫外光照射下有最大红色荧光(590nm)发出。EB的突出缺点：为中度毒性的强诱变剂,(302nm透照，254nm外照),电泳载样缓冲液(Loading buffer):核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2
27、Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有:增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内;在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置;使样品呈色，使加样操作更方便.,b.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200
28、倍.但银染色后，DNA不宜回收.,c.SYBR Green I,A minor groove binding dye,3.脉冲电泳凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE),在电场的作用下DNA可进入较小的琼脂糖凝胶孔中，大的分子只能进入大的胶孔，但需要较长的时间方能找到可进入的胶孔，所以泳动轨迹弯曲，速度缓慢。大于30kb和DNA分子在电泳中只能头尾牵引进入胶孔，需定期改变电场方向使大分子通过凝胶孔。每改变一次大的伸展的DNA分子重新定向，在新的方向上通过凝胶。通过不断交替改变电场方向，选择恰当的脉冲时间等条件，可将3510000kb的DNA分子在
29、凝胶中予以分辨。像大肠杆茵这样的原核生物,其染色体基因组DNA的长度超过4000kb。哺乳动物主要组织相容性基因座(locus)所占的DNA长度亦达数千kb。由此可见,运用普通的凝胶电泳技术显然是无法分离如此超大分子量的DNA分子的。1984年,和发明的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)技。可以成功地用来分离整条染色体这样的超大分子量的DNA分子。,在标准的脉冲电场凝胶电泳中、头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45度夹角，而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成45度夹角。由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间都在交替地变换着，使得DNA分子能够随时地调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的DNA分子相比、分子量较大的DNA分子需要更多次地更换其构型和方位，以使其可以按新的方向游动。因此，在琼脂糖介质中的迁移速率显得更慢一些，从而达到了分离超大分子量DNA分子的目的。,Contour-clamped homogeneous electric field(CHEF)(Chu,et al.,1986,1990),Increased separation of the 20-50 kb range with field inversion gel electrophoresis(FIGE),钳位均匀电场凝胶电泳,倒转电场凝胶电泳,
