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1、植物体细胞杂交,周有文,主要内容,体细胞杂交研究历程及一般概念,体细胞杂交的一般流程,杂交细胞的鉴定及相关应用领域,细胞杂交的相关文献,4,1,2,3,我们从以下几方面来探讨植物体细胞杂交技术。,发展历程,70年代，技术建立和完善优化1972年获得烟草种间体细胞杂种1975年高Ca高pH加PEG融合方法，电融合法大量成功报道，不少为异想天开的实验80年代初，由模式植物转向农作物/经济作物，对称融合到非对称融合，创造新种质的技术手段80年代末，大量木本植物细胞融合成功的报道90年代至今，成为一种育种手段,植物体细胞杂交的几个重要进展,1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成
2、功；1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物体细胞杂种；1974年，Kao将聚乙二醇（PEG）诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年，Melchers获得第一个属间体细胞杂种（番茄马铃薯）；1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。,体细胞杂交的一般概念,体细胞杂交，即原生质体融合，将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）。,
3、根据概念，在理论上任何细胞都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。,体细胞杂交与有性杂交的异同,几种不同的表述：,体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Par
4、asexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞操作：Cell manipulation 细胞工程（Cell engineering）,体细胞杂交步骤：,1 原生质体的制备2 原生质体的融合3 杂种细胞选择4 杂种细胞培养5 由愈伤组织再生植株6 杂种植株的鉴定,植物体细胞杂交技术的过程：,杂交的两个细胞,再生细胞壁,杂种细胞,脱分化,再分化,（植物体细胞融合完成的标志）,植物细胞融合,植物组织培养,植物细胞A,植物细胞B,去壁,去壁,原生质体A,原生质体B,融合,融合的原生质体AB,再生细胞壁,杂种细胞AB,脱分化,愈伤组织,杂种植株,再分化,植
5、物细胞融合,植物组织培养,植物体细胞杂交,怎样才能去除细胞壁但又不破坏细胞的生命活性呢？,酶解法,融合的原理及常用的融合方法？,物理方法：离心、振荡、电刺激化学方法：聚乙二醇（PEG）,融合可能的类型？怎样筛选杂种细胞？,植物体细胞杂交成功的标志是什么？,利用杂种细胞获得杂种植株所依据的原理？,植物细胞具全能性,酶的 专一性,生物膜的 流动性,获得的杂种植株是否能表现出人们所期望的性状？,杂种植株的鉴定,杂交细胞的筛选,细胞融合的方法及步骤,聚乙二醇 PEG）,化学方法,细胞融合流程,仙台病毒(Sendai virus),自发融合 在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体(
6、homokaryon)，每个同核体包含240个核。形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。减少自发融合的措施：在用酶液处理之前，使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，切断胞间连丝。,NaNO3处理,高PH-高浓度Ga2+,飞秒激光诱导融合,电融合芯片,空间细胞融合,原生质体融合的有关名词,对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmic hybrid,Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetric fusion）也称标准融合（Standard fusion）非对称融合（asymme
7、tric fusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分,原生质体融合的有关名词-II,供-受体融合：Donor-recipient fusion体配融合（gameto-somatic fusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：Subprotoplast-protoplast fusion 小原生质体：Miniprotoplast 微原生质体：Microprotoplast 胞质体：Cytoplast胞质体-原生质体融合:Cytoplast-protoplast fusion,微原生质体融合,植物微原生质体融合是在此基础上发展起来的将一种植物的一条或几条染色体转
8、移到另一种植物中的新的非对称原生质体融合的方法。其原理是采用适当浓度的微核诱导剂，包含DNA合成抑制剂和纺锤体毒素两大类，常用的如秋水仙素(COL)、安磺灵(oryzalin)、草胺磷除草剂(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯胺灵(CIPC)等。这些药剂可使正在分裂的植物细胞停留在有丝分裂中期，数小时后，染色体解开螺旋，形成内含多个微原生质体的微核化细胞，每个微原生质体内含有一条或几条染色体，由于有丝分裂停留在中期，每条染色体的两个姐妹染色单体仍在一起，着丝点不分开。通过酶解去掉微核化细胞的细胞壁获得微核化原生质体，再用离心等技术分离出带有一条或几条染色体的微原生
9、质体，诱导其与完整的受体原生质体融合，从而实现部分基因组的转移。微原生质体融合主要包括3个步骤:微原生质体诱导、分离以及富集、微原生质体融合和植株再生。,微核是细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞浆中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核，位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核1/3，主要由外界损害因素(生物、物理、化学)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。,根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大方式：,对称融合（symmetric
10、 fusion）即两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合（asymmetric fusion）利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。,1.PEG诱导融合法【Polyethylene glycol（PEG）】,PEG诱导融合的特点：优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。PEG作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果使原生质体发生粘连进而促进原生质体融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，
11、也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。,在细胞工程中普遍认为聚乙二醇（PEG)分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合，从而形成杂种细胞，培养该杂种细胞（细胞质杂种）可以获得一些特殊的杂种植株。,PEG融合所需试剂,融合液：pH 5.6CaCl2 2H2O 810mmolKH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol诱导液：融合液PEG 2045稀释液：A液（g/100ml）pH6.0 B液(g/100ml)pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.37
12、5 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169,一般PEG融合细胞流程,NaNO3处理,1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融合。缺点：异核体(heterokaryon)形成频率不高。,高PH-高浓度钙离子处理,1973年，Keller和Melchers，用强碱性(PH10.5)的高浓度钙离子（50mmol.L-1)溶液在37下处理约30min，两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。但对于有些原生质体系统，这样高的PH值是有毒的。,电融合仪的结构特点：交变电场部分高频直流电击部分,电融合的基本过程：,细胞膜的接触：当原生
13、质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起并圆球化。,关于融合参数：,交流电压交变电场的振幅频率交变电场的处理时间直流高频电压脉冲宽度脉冲次数,细胞电融合过程中,细胞排队、电穿孔和电融合过程都是在一定的电压条件下完成的。因此,选择合适的电压信号成为了细胞电融合过程的关键所在。与电压信号相关的参数有:电压波形、电压幅值、电压频率和电压持续时间。,飞秒激光诱导细胞融合技术,在实验中
14、,飞秒激光的中心波长为810 nm,脉冲重复频率100 MHz,脉冲宽度为40 fs,作用在被融合细胞上的平均功率为55 mW。首先使用葡聚糖酶去掉酵母细胞壁,制成原生质体。在细胞融合之前加入体积分数为10%的聚乙二醇(PEG)和0.02 mol/L的CaCl2溶液,促使原生质体细胞聚集并紧密接触。选定紧密接触的原生质体细胞对,调整载物台,使飞秒激光聚焦在质膜紧密接触的区域,通过光快门控制融合细胞被辐照时间。实验采用0.25 s的辐照时间,以CCD录像系统监测靶细胞的融合过程。实验表明,靶细胞被曝光后160 min便可融合成一个细胞。,激光诱导细胞融合技术具有显著的优点，如：1）高度的选择性，
15、可以选择任意的两个细胞之间进行融合，易于实现特定细胞融合。2）激光作用于细胞所产生的应力小、定时和定位性强、损伤小，从而提高了融合细胞的生存能力。而且，激光参数易于控制、操作方便、融合过程利于观察，实验重复性好。3）激光操控时无菌、无毒性。激光诱导细胞融合技术也有自身的缺点，如：a.技术不够成熟，需要进一步完善。b.设备非常昂贵。c.它是一种微操作技术，对实验人员和操作技术要求高，通常需要专门培训。同时，该技术每次只能靠人工操作一对细胞，过程繁琐，工作效率极差，产量也很低。,细胞电融合芯片,在细胞电融合研究向微芯片技术领域发展过程中，微电极间距缩小到几十微米，而电融合中细胞排队（约100700
16、 V/cm）与电穿孔（约18 kV/cm）所需电场条件基本不变。根据电场强度与加载电压的关系式E=V/d（E为电场强度，V为微电极两侧施加的电压，d为微电极间距），如果电极间距d=1 mm，则排队电压需要1070 V，击穿电压则高达100800 V。如果电极间距缩小到d=50m，则排队电压需要0.52.5 V，击穿电压只需要540 V。因此，当通过微加工工艺使微电极间距缩小后，所需电压信号就会大大降低，使细胞电融合系统成为可用电池供电的便携式系统。由此可见，融合芯片的研究对细胞电融合微系统整体的实现有极其重要的意义，将是该研究的一个重要内容，也是该系统发展成微全分析系统（micro total
17、 analysis system,-TAS）的基础。,电融合芯片缺点,常规电融合系统中异源细胞的准确配型难以实现与生物和化学融合方法相比，电融合方法由于效率较高、操作简便、对细胞无毒害、便于观察、适于仪器应用和规范操作，成为了主要的手段。不过，常规融合系统中融合配型难以控制，目标配型的产率仍然很低。因此，细胞电融合技术的研究进入微观层次，希望通过微操作方法来实现精确的细胞操作，从而解决融合配对特异性差的缺陷，同时提高自动化程度和融合效率。目前，显微操作的应用虽可以提高配型的准确度，但自动化程度和效率都很低。现有电融合系统中微电极数目偏少，难以提高细胞融合效率现有的电融合系统中融合电极一般只有少
18、数几对，可以同时控制和融合的细胞有限，造成融合效率不高。常规融合仪器中融合电压很高，有潜在安全隐患，也不利于设备微型化现有细胞电融合仪器中电极间距一般为2001000m，细胞电穿孔所需电压在几百伏特以上。过高的电压对实验者造成不安全因素，同时，对融合后的细胞存活率也带来不利的影响。另外，所需电压越高，细胞融合仪设备制造难度也相应提高。设备研制成本很高，体积较大，难以实现便携化，限制了该技术的广泛应用。多核融合细胞比例过高现有细胞电融合方法中，多细胞排列成细胞串的比例很高，由此带来的一个严重问题是融合细胞中多核细胞（多个细胞融合而成）的比例也相当高。这种细胞难以存活和分化，也大大降低了实际融合效
19、率。电融合芯片技术不甚完善现有电融合芯片技术还处于相当初级的阶段，电极数量少、细胞控制困难、融合配对准确性和融合效率难以同时得到保障，与其它微流控细胞研究技术的集成度也很低。,空间细胞融合技术,植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低。20世纪80年代以来,在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。空间细胞融合技术是直接为生物加工服务的,例如将抗药性或胞质雄性不育等细胞质基因导入另一个体细胞,有可能形成新的核质杂种;通过诱导不同种间、科属间原生质体融合,可以打破远源杂交不亲和性,广泛组合各种基因型,形成正常重力下无法获得的新型杂
20、种植株。,生物诱导融合法仙台病毒法,仙台病毒是一类被膜病毒，属于附黏液病毒族，它是多形性颗粒，直径为5060 nm，由两层磷脂组成的外膜包裹着RNA和蛋白质复合体，外膜上有两种糖蛋白，一种是HANA蛋白质，一种是F蛋白质，前者具有神经氨酸酶和血凝活性（分子量较大），后者具有融合和溶血作用（分子量较小）。仙台病毒诱导细胞融合的机理是：病毒被膜上的两种糖蛋白可和细胞膜表面的糖蛋白发生相互作用，从而使两个细胞可以互相接触，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞表面之间将产生一些微小的细胞质桥。随着时间的推移，细胞质桥数量和桥的体积也在增加，最后相邻细胞的细胞质就结合在一起了，形成细胞凝集块再通过膜上蛋白质
21、分子的重新排列，使膜中脂类分子重排而打开质膜，最后导致细胞融合。,在利用仙台病毒诱导细胞融合实验中主要包括以下四个步骤：（1）先将亲本细胞（待融合的细胞）分别制成悬浮液、混合离心；（2）将沉积细胞悬于灭活的仙台病毒悬液里，在4oC低温下摇动20分钟，使细胞形成凝集块；（3）再将温度升至37oC，间歇摇动30分钟，使其融合；（4）洗去病毒，将融合细胞浮于选择性培养基进行培养。由于4oC低温利于细胞聚集，在融合时需要提高温度，否则融合不会发生。,体细胞杂种的鉴定及应用领域,细胞融合产生的杂种及后代需经过杂种性质的鉴定，而体细胞杂种用于育种实践时，则应进行再生植株及后代的遗传分析，一般包括形态学标记
22、、细胞学标记、原位杂交分析以及各种生化及分子标记分析。,形态标记,形态标记即植物的外部特征，如花的形状及颜色、果实(种子)的形状及颜色、叶型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及对疾病的抗性等。形态标记简单直观，但是标记少、多态性差、易受环境条件和其它修饰基因的影响，并且许多性状为数量性状，由几个位点控制，表现为一个范围，而不是简单的性状差异。,细胞学标记,细胞标记主要包括染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)。细胞学标记位点较少，而且对于亲缘关系较近的物种，由于细胞学标记差别不明显，所以很难根据细胞学特征来区分。,同工酶标记,同工酶为共显性，父本和母
23、本的基因可以同时在后代中表达，不受环境因素影响，中仅有相对稳定;分析操作简便，所需材料较少;不足之处是位点数较少，植物1020种同工酶表现出位点的多态性，覆盖的基因组范围有限。,染色体原位杂交,染色体原位杂交（Genomic in situ hybridization，GISH）是一项利用标记的DNA探针与染色体上的DNA杂交，在染色体上直接进行检测的分子标记技术。通常用同位素或生物素、地高辛标记的DNA探针与染色体DNA杂交，通过放射自显影或通过抗原抗体反应，在荧光显微镜下观察DNA探针与其互补的DNA序列结合的位置。最大优点是可以显示在体细胞杂种中哪条染色体来源于这个亲本，哪条染色体来源于
24、另一个亲本，因而更准确、直观。,分子生物学标记,植物的分子标记主要有RApD、盯LP、AFLP、SSR、ISSR、EST等。,下面是研究得出的新品种,植物体细胞杂交方式有对称体细胞杂交、不对称体细胞杂交。对称体细胞杂交是指双方原生质体直接进行融合，双亲完整原生质体融合使所有遗传物质均匀混合和重组形成对称杂种。利用体细胞杂交可创造新物种，研究物种的起源与进化。Sundberg（1986）在进行芸薹属白菜型油菜（Brassica competris）与甘蓝（B.oleracea）体细胞杂交时成功地得到与甘蓝型油菜（B.napus）十分相似的合成种，为三者之间亲缘关系提供了有力的证据（Sundber
25、g et al,1986）。对称融合也可能产生非对称杂种和胞质杂种，非对称杂种和胞质杂种是由于一方亲本染色体被排除而形成，亲缘关系较远的两个亲本进行融合时常出现染色体被消减的现象。不对称杂交是在原生质体融合前用物理射线（X、紫外线）照射其中一个亲本使核基因组失活，然后与正常的或经化学物质（碘乙酸盐、若丹明6G）处理的原生质进行融合。物理射线（X、紫外线）照射可打断破坏亲本一方完整的染色体结构，使部分染色体被破坏失活，通过改变X、紫外线的剂量可调节染色体的失活程度，可获得各种各样核基因组组成的不对称杂种。化学试剂主要包括2种，一种是碘乙酰胺或碘乙酸（Iodoacetate，IOA），另一种是若丹
26、明6G。碘乙酰胺或碘乙酸作用机理上不清楚，若丹明6G是细胞线粒体氧化磷酸化的专性抑制剂。,原生质体融合转移CMS性状的研究现状细胞质雄性不育(CMS),在植物有性杂交中，由于胞质基因组一般具有母性遗传的特点，因此在大多数情况下得到的后代往往只具有母本的胞质基因组。相对而言，原生质体融合技术能够创造大量新的胞质基因组和新的核一质互作模式，因此在通过转移胞质基因组控制的优良农艺性状培育有潜在价值的植物资源方面具有极大的优势。在一些己经发现胞质基因组控制的性状中，胞质雄性不育(CMS)是最受关注的重要农艺性状之一。CMS具有使植物产生没有正常功能花粉的特点，因此在一些作物的制种方面有重要的意义。,谢谢大家，请大家指教,周有文,
