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1、第十八章 植物转基因技术,植物转基因技术：又称基因重组技术或DNA重组，即将人工分离和修饰过的基因导入植物基因组中，通过导入基因的表达从而引起植物体性状的可遗传的修饰。凡是外源DNA导入细胞的过程都可以泛称为转化，包含以下内容：直接转化；介导转化；,直接转化,是将裸露的DNA直接导入植物细胞的转化方法。,这种裸露的DNA可以是全部或部分染色体，分离的DNA，也可以是基因工程质粒；,介导转化,介导转化是利用另一种生物来实现基因的转入和整合。目前使用的主要是根瘤农杆菌、发根农杆菌等土壤农杆菌，转化效率较高。,直接转化与介导转化都涉及以下三方面:1、遗传物质导入植物细胞；2、外源DNA在植物基因组中
2、的稳定整合；3、转基因植株的再生。,一、直接转化,一)目的基因的获得：,(1)直接从目的生物(即供体生物)的基因组中用机械(如超声波)或限制性内切酶切断后分离出来。,(2)通过反转录酶作用,以mRNA为模板,经反转录成为互补DNA(即cDNA)。,(4)通过建立核基因库，然后从基因库中筛选并扩增出目的基因。,(3)在体外用化学合成和酶促合成的方法来获得目的基因。,二）目的基因的修饰，构成嵌合基因：嵌合基因中必有启动子（如花椰菜病毒的35s亚基启动子、19s亚基启动子），目的基因及终止子。三）嵌入标记基因或报告基因：应用较广的是 GUS 基因；绿色荧光蛋白基因。,基因枪法：微弹为的钨粉或者金粉，
3、用超声波使外源 DNA液均匀的包裹钨粉微粒手枪原理射击。,四）直接转化的方法：,电穿孔转化法：用短时高脉冲电处理可导致细胞膜出现可恢复性孔隙，从而发生的渗透点34nm为外源DNA进入细胞提供通路。,PEG转化法：PEG转化法和PEG诱导原生质体融合方法相似，同样需要高钙、高pH条件从而将外源DNA插入原生质体并整合。,五）、转化基因材料的分析与鉴定,（1）GUS 测定：GUS基因的表达产物是葡糖苷酸酶，它可分解葡糖苷酸，葡糖苷酸被分解后形成蓝色产物使植物组织成为蓝色。,（2）southern 杂交法：用放射性同位素32P标记一段DNA分子及探针,与转化植物或其他被分析个体的总DNA杂交,可以探
4、测转化植物是否含有与探针同源的DNA序列,通过放射自显影可看到杂交片断并测分子量大小。,（3）蛋白质杂交技术：蛋白质抗原与其相应的特异抗体相结合。（4）PCR反应：根据已知转化基因或标记基因顺序设计引物，（5）遗传分析：观察基因是否可以稳定遗传给下一代。（6）鉴定转化基因的功能。,实例 小麦的基因枪转化,1、试验材料：小麦幼胚（开花后1012天）2、质粒的制备：转化所用质粒为pABH9，该质粒插入BADH基因（表达产物是甜菜碱醛脱氢酶，提高植物细胞的调渗能力和耐盐性）和BAR基因（表达产物是PPT已酰转移酶，抗除草剂PPT，因此可利用PPT作为转化物的选择剂），由玉米启动子控制，并含有nos中
5、止子。,3、幼胚的高渗预培养：4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）：5、抗PPT愈伤组织的选择：白色生长快的为 外源质粒转化的愈伤（见图）。6、抗PPT再生植株的获得：（见图）,实例 小麦的基因枪转化,7、抗PPT转化植株的耐盐性：含盐0.7NaCl条件下转化植株表现较强的耐盐性。8、转化植株的壮苗、生根、移栽、传代。9、转BADH基因植株的分子检测：根据已知的BADH结构基因设计引物用PCR法鉴定外源 BADH基因是否整合到小麦基因组中。也可以进一步用 Southern 杂交验证。,实例 小麦的基因枪转化,农杆菌是普遍存在于土壤中的抑制革兰氏阴性菌，能在自然条件下趋化性的感染大多数的双子叶植
6、物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤（根瘤农杆菌）和发状根（发根农杆菌）。分别含有Ti质粒和Ri质粒。,二、农杆菌介导转化,一）土壤农杆菌的转化机理,致瘤性（tumorinducing）是由Ti质粒上的T-DNA所致,（一）.土壤农杆菌感染植物的过程：,（二）、Ti质粒：,Ti质粒的大小约200kb左右，为双链环状DNA分子。含有T-DNA区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点.其中以T-DNA区和毒性区（vir-region）在植物转化中最为重要。,T-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组，并能在植物细胞中表达，从而导致 冠瘿瘤发生。Vir区：由多个毒性基因组成，其编码蛋白对
7、 T-DNA的转移和整合 必不可少。,1.Ti质粒上的T-DNA：,仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整合到植物基因组中，T-DNA以单拷贝或多拷贝形式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。,T-DNA 从农杆菌的 Ti 质粒转移到植物细胞中，接着 T-DNA 整合到细胞核基因组中进行表达，对宿主细胞进行遗传转化。,在 Ti 质粒的两端，T-DNA有两个几乎完全相同的 25bp 的重复。右端重复对于 T-DNA的转移和整合是必需的。T-DNA 与植物基因组中的右接口拼接相当精确，右边接口保留有 1-2bp 的右端重复，但左边接口处序列变化较大，有大约 100bp 以内的序列来自左边界。,2.
8、Ti质粒适用于植物基因转化的重要特性（或转化原理）：,第一,保留T-DNA两端的末端序列,然后用一段外源DNA插人或直接取代野生型T-DNA的部分基因组,这段外源DNA仍然可以进入植物细胞,整合到植物的染色体组上（卸甲载体：disarmed vector）。,其次，T-DNA的末端序列由25个核苷酸序列组成，它们的左右端序列都具有高度的同源性，并且末端序列对T-DNA转移到植物细胞内具有重要意义。,第三,毒性区是控制T-DNA转移的，而且毒性区对T-DNA的作用既可以以顺式(in cis)方式进行,又可以以反式(in trans)方式进行。,3、Ti质粒上的毒性区：,Ti质粒的毒性区约有30k
9、b大小,由7个互补群组成,分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirF和VirH。,毒性区的大多数基因产物都控制T-DNA的转移。在这个区域内的突变往往导致土壤农杆菌感染植物的能力下降。,Ti质粒衍生的载体系统,删除生长素基因，细胞分裂素基因和冠瘿 碱基因，使质粒大大减小。插入E.coli复制原点，使Ti质粒能在大肠 杆菌中繁殖。3 具有选择型标记基因，便于转化体的筛选。4 含有多克隆位点，便于目的基因的克隆。,二）、转化载体系统：,Ti质粒载体系统一般分为两类：一类叫共整合载体系统；一类叫双元载体系统。,（一）、共整合载体质粒：,1.pGV3850系统:这是
10、第一个非致癌的Ti质粒衍生载体,来自胭脂碱型质粒pTiC58Trac,包括25bp末端序列和胭脂碱合成酶基因,T-DNA上的其它基因则为pBR322序列取代。,2.pGV2260系统:来自章鱼碱型Ti质粒pTiB63,整个T-DNA序列连同25bp未端序列均被一段pBR322所取代。,这种系统需要两个彼此分离的质粒：一个是多功能克隆载体质粒，在大肠杆菌和土壤农杆菌中都能够复制；另一个是Ti衍生质粒,如 pGV2260,可以提供反式的毒性区功能,以便TDNA转移到植物中去。,（二）、双元载体系统：,农杆菌转化过程：对植物表面部位的识别和附着：植物伤口分泌 的酚类小分子物质可以诱导Vir基因活化并
11、表达。T-DNA进行复制和转移：Vir产物能诱导Ti质粒 复制产生一新的单链T-DNA分子，并使其转移到 植物细胞中。T-DNA的整合：在Vir产物作用下，T-DNA转入 细胞核，并整合到植物染色体上。,1 原生质体或悬浮细胞与农杆菌共培养2 叶盘转化法其它外植体转化法：如桃的茎断胚胎愈伤 组织、核桃的体细胞胚、草莓的下胚轴等。4 整株感染法。,实例：农杆菌介导的水稻基因转化,1、水稻愈伤组织诱导：以水稻成熟胚的盾片愈伤组织为转基因受体。2、菌株和质粒。3、转化程序。,转化后的GUS的瞬间表达,转化后3周产生的抗性愈伤组织,抗性愈伤的GUS反应,再生的转化植株,转化植株叶片的GUS表达,抗性植
12、株后代的抗性检测,第二节 转基因植物,自1983年人类首次获得转基因植物后，已有大量的抗病、抗逆及品质改良的转基因植物获得成功，在农业生产上已经发挥了重要的作用。在转基因技术基础上发展起来的植物生物反应器展现了诱人的发展前景。,1.植物抗虫基因工程 我国科学家成功地人工合成和改造的Bt基因转入花，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。2.植物抗病基因工程 中国农业科学院生物技术研究所成功将抗菌肽基因导入马铃薯，获得抗青枯病的转基因株系；北京大学克隆了烟草花叶病毒TMV，黄瓜花叶病毒CMV等基因。,3.植物抗逆基因工程 我国在抗盐基因工程上已取得了一些进展，先后克隆了脯氨酸合成酶、山菠菜碱脱氢
13、酶、磷酸甘露醇脱氢酶等耐盐相关基因，并获得了抗盐的转基因植物。4.植物品质改良的基因工程 将编码必需氨基酸的基因转入马铃薯，获得含高必需氨基酸的马铃薯品系；将高赖氨酸基因导入玉米获得含高赖氨酸的转基因玉米；获得储存时间延长的转基因番茄。,5.植物叶绿体基因工程 进行叶绿体遗传转化研究，建立了烟草叶绿体遗传转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。6.植物生物反应器 利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白，利用转基因植物生产口服疫苗，大大降低疫苗的生产成本。,基因工程育种的优点,（1）基因资源丰富：植物、动物和微生物等；（）转入的某性状具连续性和整体性；（）育种周期短，成本低；（）基因育种具不污染环境等优点；,思 考 题 1哪些因素会影响培养物的遗传变异？2体细胞无性系变异的诱导和选择方法。3常见的基因转化技术有哪些？,
