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1、污染控制微生物学,第七章 微生物的生长繁殖,生长和繁殖统称为发育，发育是一个复杂的生命活动。当微生物吸收营养物质后，通过合成代谢作用，合成新的细胞成分，使菌体的重量增加(主要是原生质和其他组成成分有规律地增加)，菌体体积长大，这种现象称为生长。细胞的生长是有限度的，当细胞增长到一定程度时就开始分裂，这种菌体数量增多的现象称为繁殖。生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。生长和繁殖虽有区别，但关系十分密切。微生物群体在生长过程中，个体的细胞体积和重量变化不易被察觉，所以，常以细胞数量的增加或以细胞群体重量的增加作为生长繁殖的指标。,微生物纯培养的生长,微生物学中将在实验室条件下，从一个细胞或一种细胞
2、群繁殖得到的后代称为纯培养。相对应的称为不纯培养物。纯培养的分离方法稀释倒平皿法 将待分离的材料作一系列稀释(如1:10、1:100、1:1 000、1:10 000)，取不同稀释液各少许与已熔化并冷却至45 的琼脂培养基相混合，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂培养基凝固后，保温培养一定,微生物纯培养的生长,时间，即有菌落出现。如果稀释得当，平皿中出现分散的单个菌落便可能是由一个细菌繁殖所形成。挑取此单个菌落或再重复以上操作数次，可得到纯培养。,微生物纯培养的生长,划线法 将熔化的琼脂培养基倾入无菌培养皿中，冷凝后，用接种环NFDCB取少许待分离材料，在培养基表面连续划线，如，可作平行划线、扇形划
3、线或其他形式连续划线，随着接种环在培养基上的移动，细菌得以分散，经保温培养即形成菌落。在划线的开始部分，细菌分散度小，形成菌落往往连在一起。但由于连续划线，细菌逐渐减少，划到最后常可形成单独孤立的菌落。,微生物纯培养的生长,这种单独的菌落可能是由单个细胞形成的，因而获得纯培养。用其他工具如形玻棒代替接种环在琼脂培养基表面涂布，亦可得到同样结果。,微生物纯培养的生长,单细胞挑取法 单细胞挑取法是从待分离材料中只挑取一个细胞来培养。可用一台显微挑取器，装置于显微镜上，把一滴细菌悬浮液置于载玻片上，用装于显微挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准一个单独的细菌细胞挑取，再接种于培养基上培养而得纯培
4、养。,微生物纯培养的生长,利用选择培养基分离法 不同的细菌需要不同的营养物。因此，可以把培养基配制成适合于某种细菌生长而限制其他细菌生长的环境。这样的选择培养基可用来分离培养纯种。也可以将待分离的样品先进行适当处理，以排除不需要的微生物。例如，想分离得到芽孢细菌，可在倒平皿前将样品在高温处理一段时间，以破坏所有的或大部分的非芽孢细菌，这样分离得到的菌落将是芽孢形成菌。,微生物纯培养分离方法的比较,微生物纯培养的生长,微生物生长量的测定 主要有测定微生物的数量、重量和细胞物质成分等方法。测定微生物的数量 1.全数测定(直接计数法)(1)计数器直接计数法(2)涂片染色计数(3)比浊法,微生物纯培养
5、的生长,微生物纯培养的生长,2.活菌计数(间接计数法)(1)平板计数法(2)薄膜过滤计数法,微生物纯培养的生长,测定细胞物质的重量 采用干重法，用离心或过滤的方法将菌体从菌悬液中分离出来，洗净，烘干，称重，求得单位容积菌悬液中细胞的干重。这是测定细胞重量较为直接而可靠的方法，但只适用于菌体浓度较高的样品，而且要求样品中不含菌体以外的其他干物质。在活性污泥法中常采用干重法来测定活性污泥的重量，以近似代表活性污泥中微生物的量，这一指标称为活性污泥浓度(符号为MLSS)，它表示每升活性污泥混合液中活性污泥的毫克数。这种测定结果既包括活菌和死菌量，又包括有机颗粒和无机盐类的重量，因而，这一指标随非生物
6、物质含量的增加，可靠性降低。,微生物纯培养的生长,DNA含量测定法 由于DNA在细胞生长中起重要作用，所以，测定DNA的含量也是研究微生物生长的一种重要的化学测定方法。DNA的测定不但可以反映细胞物质的重量，并且由于每个细菌细胞中DNA含量对于某类群微生物来说较恒定(平均为8.410-5)，所以，通过测定细菌的DNA还可推算出细菌细胞的数量。此外，还可采用测定ATP的方法，但由于细胞内ATP含量随发育阶段的不同而变化较大，因而，用于反映微生物量不如DNA佳。,微生物的生长曲线,细菌纯培养的生长曲线 研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或称为间歇培养(batch culture)。分批培养就
7、是在一定体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件(如温度、pH、溶解氧等)进行培养，结果出现了细菌数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，可得图所示的曲线。,微生物的生长曲线,迟缓期(lag phase)迟缓期又称滞留适应期。当菌种接种到新鲜培养基后，细菌并不立即生长繁殖，而要经过一段时间的调整和适应，以合成多种酶，并完善体内的酶系统和细胞的其他成分。在这个时期，细胞的代谢活力很强，蛋白质和RNA含量增加，菌体体积显著增大。在迟缓期末，
8、细菌的长度可达接种时的6倍。迟缓期末期和对数期前期的细胞，对热、化学物质等不良条件的抵抗力减弱。,细菌的生长曲线可以分为四个时期,微生物的生长曲线,迟缓期持续时间的长短随菌种特性、接种量、菌龄与移种至新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同等因素有关，短的只几分钟，长的可达几小时。如果用对数期的细菌接种到相同的培养基上，并在同一温度下培养，细菌则仍以原来的生长速度继续对数生长，而不会出现迟缓期，因而可以缩短培养时间。,微生物的生长曲线,对数期(log phase)迟缓期末，细胞开始出现分裂，培养液中的菌数增加，进入对数期。在此时期，以细菌数的对数与培养时间做图则成一直线。对数期细菌按几何级数增加，
9、1248，即202122232n。每分裂一次为一个世代，每经过一个世代，群体数目增加一倍。可见，细菌的群体生长是按指数速率进行的，因而亦称做指数增长。细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示,微生物的生长曲线,细菌群体的这种指数增长可用以下方程式表示：2=1 2式中：1、2分别为时间1和2时刻的细胞数；世代数。世代时间是由遗传性决定的，不同菌种对数期的世代时间不同，同一菌种的世代时间受培养基组成及物理环境的影响也不同。对数期细菌的生长速度达到高潮，世代时间最短，细胞的代谢活性比较稳定，酶的活力也高。这个时期的细胞是作为研究工作的理想材料。,微生物的生长曲线,稳定期(stationary pha
10、se)由于在生长过程中，营养物质不断被消耗，同时，某些有毒性的代谢产物不断积累，致使细菌分裂的速率降低，世代时间延长，细菌细胞活力减退。这时，群体中细菌的繁殖速度与死亡速度近乎相等，活菌数目保持稳定。处于稳定期的细胞开始积累体内贮藏物质，如肝糖粒、淀粉粒、异染颗粒等，研究认为，此时菌胶团细菌大量分泌体外贮藏物质荚膜，所以，更易形成菌胶团。大多数产芽孢细菌在此时期开始产生芽孢。,微生物的生长曲线,衰亡期(death phase)此期环境变得更不适于微生物生长，细胞的活力继续衰退，死亡率大于繁殖率，活菌数迅速减少。在衰亡期中细胞形状和大小很不一致，有些产生畸形细胞，细菌的生命活动主要依赖于内源呼吸
11、，并呈现大量死亡。微生物的生长曲线反映一种微生物在一定生活环境中的生长繁殖和死亡规律。它既可作为营养和环境影响的理论研究指标，亦可作为调控微生物生长发育的依据，指导微生物生产实践。,微生物的生长曲线,微生物的生长曲线,连续培养 研究细菌纯培养的生长曲线是采用分批培养，或称为间歇培养(batch culture)。分批培养就是在一定体积的液体培养基中接种少量细菌并保持一定的条件(如温度、pH、溶解氧等)进行培养，结果出现了细菌数量由少到多，并达到高峰，又由多变少的变化规律。测定生长曲线时，将少量经纯培养的细菌接种到经灭菌的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细菌数量。以细菌数的对数为纵坐
12、标，生长时间为横坐标，可得图所示的曲线。,连续培养：是一种让新鲜培养基不断流入，失效培养基不断流出，以维持培养基组成相应稳定、避免代谢产物积累，从而使对数生长期能较长时间维持下去的一种培养方法。装置：培养基贮存系统、新鲜培养基的流入系统、培养物流出系统和控制系统。目的：培养物的密度或培养基的化学组成维 持在一定的水平上,微生物的生长曲线,连续培养装置的类型 连续培养装置有两种类型：恒化器连续培养装置 恒浊器连续培养装置 常用的一种连续培养方法为恒化连续培养。,微生物的生长曲线,微生物的生长曲线,恒化器连续培养装置 通过控制培养基中某种限制性营养物质浓度在一定范围内变化，以控制机体生长速率的变化
13、，从而控制新鲜培养基流入的速率。当某种营养物质浓度低于或高于原定范围时，就会通过控制系统，调整培养基流入的速率，以提高或降低这种物质的浓度，从而使微生物生长速率维持一定，保证连续培养正常进行。,微生物的生长曲线,在这种装置中，微生物的生长速度可以通过调节限制性底物浓度或培养基的流速加以控制。通常只需要限制某一种底物(如氮源或能源)的浓度，就可以调节生长速度。,活性污泥增长曲线 在废水生物处理中，为了描述活性污泥中微生物的生长，常采用间歇培养法获得图所示的曲线。活性污泥中的微生物种类繁多，不仅包括细菌，而且还含有原生动物和后生动物等微生物，因此，不是纯培养的生长曲线，但曲线形式与纯培养的类似。活
14、性污泥增长曲线可以分为三个时期：对数生长期、减速生长期和内源呼吸期。,微生物的生长曲线,对数生长期 此期，微生物处在营养物质过剩的环境中，微生物以最大的速率氧化分解废水中的有机物，并合成新的细胞物质，因此，微生物迅速增长。这一时期相当于纯培养生长曲线中的对数期。在此期间，活性污泥微生物具有很高的能量水平，因而不能形成良好的活性污泥絮凝体。,微生物的生长曲线,在对数生长期，活性污泥微生物的增长速率一般可用下式表示：式中：X时刻挥发性活性污泥浓度(MLVSS)，(也可由活性污泥浓度MLVSS代替)；K1挥发性活性污泥的增长速度常数。,微生物的生长曲线,减速生长期 此期营养物质不再过剩，而且成为微生
15、物进一步生长的限制因素。科学实验表明，此时有机底物的去除率与存在的有机底物浓度成正比。式中：S某一时间时的有机底物浓度；K2有机底物降解常数。,微生物的生长曲线,内源呼吸期 此时营养物质近乎耗尽，所以活性污泥微生物靠内源呼吸维持生命活动，并使活性污泥量减少。由于能量水平低，絮凝体形成速率增加，吸附有机物的能力显著，但污泥活性降低。值得提出的是活性污泥内源呼吸过程不只出现在内源呼吸期，在前两期中都不同程度地存在，只是在内源呼吸期表现得更为明显。,微生物的生长曲线,内源呼吸期活性污泥的增长量可表示为：式中：3 挥发性活性污泥内源呼吸速度常数。在实际中常将活性污泥控制在减速生长末期和内源呼吸初期。而高负荷活性污泥处理法是利用微生物生长的对数期；延时曝气法是利用微生物生长的衰亡期，因有机物浓度低，故延长曝气时间，以增大进水流量达到提高有机负荷的目的。,微生物的生长曲线,1.微生物直接计数法有哪些?间接计数法有哪些?2.怎样利用平板菌落计数法测水中的细菌总数?3.细菌纯培养的分离方法有哪些?4.怎样获得细菌纯培养的生长曲线?并分析生长曲线各时期的特点。5.活性污泥法处理有机废水应将污泥控制在哪个时期?为什么?,思 考 题,
