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1、,第六章 流式细胞技术的原理与应用,Flow Cytometry,山东师范大学生命科学学院 杨桂文,一、流式细胞仪概述,流式细胞仪（Flow Cytometry,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。所谓流式细胞术，就是利用流式细胞仪对细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球；研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。,流式细胞仪分为三大类：台式机，临床型，特点：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学掌握。大型机，科研型，特点：分辨率
2、高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于更广泛灵活的科学研究。新型流式细胞仪，特点：随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测13个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数同时分析。还可以实验现高速分先，速度达到50000个/s，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。,液流系统光学系统电子系统分选系统,二、流式细胞仪的结构组成,Principles of Flow Cytometric analysis,三、流式细胞仪的基本结构,液流系统,液流系统的作用是依次传送待测样本中的细
3、胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。,光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束-激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。,光学系统,分选系统,Fluorochrome specification,电子系统负责光电转换和数据处理,1 散射光信号,激发光,光散射分析：从非均一的细胞群体中鉴别出某些亚群,侧向角散射光（SSC）Side Scatter：细胞粒度及细胞内相对复杂性,前
4、向角散射光（FSC）Forward Scatter：细胞相对大小及其表面积,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,白细胞,淋巴细胞,单核细胞,粒细胞,根据散射光信号从人白细胞中鉴别出不同亚群：,流式细胞仪的信号分析,流式细胞仪的信号分析,2荧光信号,利用荧光标记的特异性单克隆抗体，做单/多色分析：检测多种细胞表面标志，定量细胞抗原表达、细胞因子水平 为PCR、FISH 等分子技术分选出纯度高的特异细胞群,荧光信号的分析,流式细胞仪的信号分析,数据存储:LIST MODE,数据显示:直方图(Histogram)二维点图(Dot Plot)等高线图(Contour Plot)密度图(Den
5、sity)三维图（3D Plot）等,流式细胞仪的数据分析,点图分析,流式细胞仪的数据分析,流式细胞仪的工作原理,将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。,流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上
6、反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。,这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或
7、1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。,细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。,流 式 仪 器 一 览,BD-流式技术的先锋全球第一台流式细胞仪 FACS I（1973）全球第一台全自动4色流式细
8、胞仪 FACSCalibur全球第一台免校准,双激光6色流式细胞仪 BD LSR 落地式流式细胞分选仪 FACSVantageSE全球第一台高速流式细胞分选仪 FACSAria经济普及型流式细胞仪 FACSCount Market share of BD FCM：worldwide 75%，China 70%,流式细胞仪一览,流式细胞仪一览,BD FACSAria,BD FACSCalibur,BD FACS VantageSE,BD LSR,New,Common,流式细胞仪一览,流 式 应 用 一 览,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期蛋白质含量RNA含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核内特异性抗原细胞活性和酶活性细胞因子和受体激素结合位点胞内钙离子浓度,流式分析应用一览,流式分析应用一览,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的科研应用,树突状细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 流式细胞术与分子生物学研究,流式分析应用一览,
