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1、流感病毒及SARS病毒感染及其致病性研究Influenza/SARS-CoV Virus Infection and Its Pathogenesis,流感病毒流行历史与现状,希波拉底(古希腊医生，被誉为医学之父)记载的流感疫情最早始于公元前412年。1933年英国人威尔逊史密斯（Wilson Smith）第一次分离出人流感病毒。流感病毒每隔一定的时间就会在世界不同地区发生。自1997-至今，在亚洲及全世界暴发H5N1血清亚型的高致病禽流感,Influenza pandemic in history,H1N1:The Spanish flu that killed 50 million peo
2、ple worldwide from 1918 to 1919(scientists identified its proteins long after the pandemic was over)H2N2:The Asian flu that caused a pandemic from 1957 to 1958 H3N2:The Hong Kong flu,which caused the worlds most recent pandemic in 1968,19181919年世紀西班牙流感病毒死亡人数估计2000 5000万人,An Emergency Hospital for In
3、fluenza Patients,流感病毒简介,Influenza Virus有包膜的单链负义RNA病毒正黏病毒科直径80120nm，呈球形或丝状分A、B、C（甲、乙、丙）三型,流感病毒的分类,根据NP抗原性，将流感病毒分为A、B、C(甲、乙、丙）三型,三型病毒具有相似的生化和生物学特征。A型流感病毒常以流行形式出现，能引起世界性流感大流行，它在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。B型流感病毒常常引起局部爆发，不引起世界性流感大流行，至今尚未找到它存在于人之外其它动物中的确凿证据。C型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行，猪也是它天然宿主之一。,
4、Influenza Virus infection in MDCK cells狗肾细胞,What Is Influenza Virus Like?,流感病毒的结构,由三层构成 内层为病毒核衣壳，含核蛋白（NP）、P蛋白和RNA。NP是可溶性抗原，具有型特异性，抗原性稳定。P蛋白（PB1、PB2、PA）是病毒RNA聚合酶亚单位。,流感病毒的结构,中层为基质蛋白，它构成了病毒的外壳骨架。实际上骨架中除了基质蛋白(M1)之外还有膜蛋白(M2)。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。M1抗原性稳定，也具有型特异性。,流感病毒的结构,外层为病毒包膜，是包裹在基质蛋白
5、之外的一层磷脂双分子层膜，其上具有两种不同糖蛋白构成的辐射状突起，即血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶(neuraminidase，NA),流感病毒的结构,HA（右上）能引起红细胞凝集，是病毒吸咐于敏感细胞表面的工具。NA（右下）则能水解蛋白，水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰神经氨酸，是病毒复制完成后脱离细胞表面的工具。HA和NA均有变异特性，故只有株特异的抗原性，其抗体具有保护作用。,流感病毒的抗原性变异,在亚型内部经常发生小变异（量变），称为抗原漂移（antigenic drift）。大的抗原变异出现的亚型（质变）即称抗原转变（antigenic shift）
6、，其为H和（或）N都发生了大的变异，由此而产生新的亚型，可引起世界性大流行。,流感病毒的抗原性变异就是指HA和NA抗原结构的改变，主要是HA。,流感病毒的抗原性变异,HA：15种亚型变异。NA：9种亚型变异。A型流感病毒的抗原变异较快，23年可发生一次。B型流感病毒的抗原变异很慢，未划分成亚型转变。C型流感病毒尚未发现抗原变异。,流感病毒的基因组,8个独立的RNA片段（A型、B型）或7个独立的RNA片段（C型）核酸总长度为约13.6 kb所有RNA片段5末端的13个核苷酸及3末端的12个核苷酸高度保守，且5端与3端反向互补结构。共编码10种蛋白质，其中8种（PB1、PB2、PA、HA、NA、N
7、P、M1、M2）为结构蛋白，2种（NS1、NS2）为非结构蛋白。,流感病毒的基因组,流感病毒的基因组,RNA13 编码PB2、PB1和PA蛋白。RNA4 编码HA蛋白。RNA5 编码NP蛋白。RNA6 编码NA蛋白。RNA7 编码M1，M2蛋白。RNA8 编码NS1，NS2蛋白,Influenza A viral genome,NS1,NS2检测目标?,流感病毒的感染及复制过程,吸附 侵入 脱壳 表达、复制及装配 成熟及释放,流感病毒的感染及复制过程,流感病毒的吸附,流感病毒的NA可破坏宿主呼吸道的神经氨酸，使蛋白水解，暴露出呼吸道上皮表面特异性的含唾液酸的糖蛋白受体。这种受体与病毒包膜上HA
8、中的糖蛋白成分可专一地结合，从而使病毒粘附至呼吸道上皮表面。,流感病毒的侵入,病毒吸附至宿主细胞表面后，其包膜可通过与宿主细胞质膜融合形成包囊，并通过受体介导的胞吞作用进入细胞内。,流感病毒的脱壳,进入宿主细胞的包囊很快与细胞的溶酶体结合，此时包囊中的pH可降至5左右。在这样的低pH环境下，病毒的HA裂解为HA1和HA2两个亚单位，激活存在于HA2氨基酸末端的溶解多肽，导致外壳的溶解，使病毒的内容物（vRNP）释放入胞浆中，在ATP供能的条件下通过宿主细胞的核孔复合物转运至细胞核内。,流感病毒的表达、复制及装配,病毒蛋白的合成，NP、P蛋白和NS1在感染后数小时即生成，其它蛋白如HA、NA、M
9、1、M2和NS2合成较晚。病毒蛋白合成时间的控制可能受到病毒mRNA向核外运输的调节，并可能与病毒蛋白NS1的功能有关。,流感病毒的成熟及释放,病毒成熟前，各种病毒成分已结合在细胞表面，最后通过出芽的方式，使局部的细胞膜向外隆起，包围住结合在细胞膜上的核衣壳，成为新合成的有感染力的病毒。,流感病毒的成熟及释放,？子代病毒包膜上的的HA分子是否会与宿主细胞表面的唾液酸分子结合，从而病毒无法释放？子代病毒是否会因包膜上既有HA分子又有唾液酸分子而彼此吸附形成聚集？,病毒包膜上的NA分子可水解去处细胞膜表面的唾液酸残基，促使完整的病毒颗粒从细胞释放。,反向遗传技术-12 plasmids syste
10、m,反向遗传技术-8 plasmids system,Symptoms of Influenza,fever(usually high)headache extreme tiredness dry cough sore throat,runny or stuffy nose muscle aches Stomach symptoms,such as nausea,vomiting,and diarrhea,also can occur but are more common in children than adults,病理,人体通过呼吸吸入病毒颗粒病毒通过HA进入呼吸系统的表皮细胞由于病毒
11、导致细胞死亡，产生了炎症反应，咳嗽进一步加速了病毒的传播由于dsRNA的出现触发了干扰素的生成，更多流感的症状(打喷嚏，热病，冷颤，肌肉酸疼，头疼，疲劳)产生因为流感对呼吸系统的伤害，更多严重的疾病(如肺炎)并发。,3 DAYS pi,7 DAYS pi,Normal mucosa,逃逸免疫系统杀伤的机制,产生NS1蛋白，抑制PKR激活。NS1蛋白与双链RNA结合，防止双链RNA激活PKR*。*流感病毒的双链RNA可诱导细胞产生干扰素（INF），INF结合至细胞相应受体，使细胞产生大量蛋白激酶即PKR，PKR可磷酸化真核细胞翻译起始所必需的eIF2蛋白，从而关闭细胞蛋白合成，使病毒无法合成蛋白
12、而死亡。包膜上抗原蛋白突变，逃避体液免疫。,How Is the Flu Spread?,Flu viruses spread mainly from person to person through coughing or sneezing of people with influenza.Sometimes people may become infected by touching something with flu viruses on it and then touching their mouth or nose.,流感病毒的传播,患者一个激烈的咳嗽反射能将含有病毒的微液滴以每小
13、时约100英里的速度排出，且每个微液滴中含有上百万个病毒颗粒，而启动一个个体的感染仅仅需要几个或几十个病毒颗粒。这就导致了流感病毒可快速高效地传播。,流感的预防措施,自我保护保持良好的个人及环境卫生。勤洗手，使用肥皂或洗手液并用流动水洗手，不用污浊的毛巾擦手。双手接触呼吸道分泌物后（如打喷嚏后）应立即洗手。打喷嚏或咳嗽时应用手帕或纸巾掩住口鼻，避免飞沫污染他人。流感患者在家或外出时佩戴口罩，以免传染他人。均衡饮食、适量运动、充足休息，避免过度疲劳。每天开窗通风数次（冬天要避免穿堂风），保持室内空气新鲜。在流感高发期，尽量不到人多拥挤、空气污浊的场所；不得已必须去时，最好戴口罩。,流感的预防措施
14、,疫苗接种 流感疫苗接种是世界公认的预防流感的有效方法。实践证明，免疫预防是减少流感危害的一种重要措施和手段，对高危人群、易感人群接种流感疫苗是预防流感的有效方法。,The inactivated vaccine 灭活疫苗,Short lived protective;Usually given in the fall so that protection is high in December/January;Only certain formulations of the vaccine are FDA certified for young children,The live,atten
15、uated influenza virus(LAIV)vaccine减毒活疫苗,Only approved for healthy individuals；Given nasally and should provide mucosal,humoral and cell-mediated immunity；It needs to be given every year；ontraindicated for those allergic to eggs；Contraindicated for children and adolescents on any therapy containing a
16、spirin,流感病毒扩增与检测,扩增：接种9日龄鸡胚，收获尿囊液；MDCK细胞(依赖胰蛋白酶)检测：1、血球凝集试验，鸡红细胞(快)豚鼠，人红细胞(慢)2、ELISA(需要流感病毒抗体)3、RT-PCR检测病毒的RNA4、Real-Time PCR确定病毒RNA的数量,关于禽流感（AIV）,香港1997年H5N1禽流感病毒感染人引起18人发病，至今，已有数百人感染H5N1引起死亡的报道。,Reservoir Hosts,HumansHorses,birds,and pigs,Avian flu H5N1 has become common in Asian poultry.Officials
17、 believe open-air poultry markets lead to the spread of the disease.,高密度开放式运输和存放导致AIV快速传播,Infecting Other Species.,In 2004,avian flu H5N1 infected and killed tigers,leopards and cats.The potential danger is much more severe.,Fear and Panic Has Induced by the Bird Flu,Does the Azrael Return?,流感病毒感染与炎
18、症基因连锁反应,流感病毒(dsRNA)(NS1)105 病人,炎症反应,病毒感染与炎症反应临床症状疼痛和发烧全身炎症反应局部炎症反应慢性炎症与癌症密切相关,研究背景介绍,人体有两种类型COX，COX-1，COX-2 COX-1:组成性表达 COX-2:沉默，感染诱导表达2.COX-2:参与炎症反应(疼痛和发烧)3.阿司匹林可以抑制COX-2表达起到抗炎效果。全球使用最广泛的抗炎药物阿司匹林消耗17,500 吨/年,环加氧酶Cyclooxygenase,研究背景介绍,炎症基因：环加氧酶-2Cyclooxygenase-2(COX-2)花生四烯酸 Arachidonic Acid前列腺素 Pros
19、taglandins,L,研究背景介绍,Sir John Vane诺贝尔奖,Chronic Inflammation(lung),COX-2:involved in inflammation 炎症,Normal Blood Vessel,Tissue Inflammation,炎症反应的双面性正面作用：正常炎症反应可清除病毒感染，促进组织修复，对人体有益，但过度炎症反应对人体有害。负面作用：扰乱正常生理参数，感染死亡率增加。COX-2-/-鼠对流感病毒感染病症减轻，死亡率降低，但是肺组织中的病毒量明显上升。（病毒有可能与机体和平共处）,诱导型NO合成酶 iNOS:involved in inf
20、lammation,NO是人体重要的信号分子,三种类型的NO合成酶,Discovery of signalling moleculer NO,流感病毒感染与炎症基因连锁反应,流感病毒(dsRNA)(NS1)105 病人,炎症反应,COX-2,IL-32 and iNOS are induced in response to AIV infection or dsRNA treatment in a time-dependent manner.,A,B,C,COX-2 is upstream of IL-32 and iNOS in inflammatory response.,A,B,IL-3
21、2,up-regulation of iNOS and negative feedback to COX-2,A,B,Bar siRNA-control siRNA-IL-32 pCOX-2-Luc poly(IC)+IFN-,Bar siRNA-control siRNA-IL-32 phiNOS-Luc poly(IC)+IFN-,A,B,C,D,Knock down IL-32 by siRNA abolished feedback inhibition to COX-2 and up-regulation of iNOS,feedback inhibition of iNOS to I
22、L-32 and cascade feedback from iNOS to COX-2,Summary,PLoSONE 2008,e1985,SARS-CoV,重症急性呼吸综合症冠状病毒SARS Coronavirus,SARS CoV,SARS 2002年底在佛山首次报道,SARS-Coronavirus,早期称非典型性肺炎“非典”，后期称Severe Acute Respiratory Syndrome 英文简称是“SARS”。引起疾病的病原体是冠状病毒的一个变种（新型冠状病毒），科学家将其命名为“SARS-CoV”。在无生命物体表面可存活24h，在人类排泄物中存活4天，潜伏期112天，
23、平均4.5天。果子狸是SARS病毒的主要载体。SARS病毒对一些普通消毒剂就很敏感，能在5min内将其杀死，如10%甲醛、10%次氯酸钠、75%乙醇和2%苯酚混合液。56以上高温可在30min内将其杀死，SARS病毒对抗菌药物不敏感。,多形性，单正链RNA，不分节段，螺旋对称人呼吸道冠状病毒包膜表面有突起（呈花瓣状，排列为一圈）人冠状病毒据中和试验至少可分三个血清型可引起普通感冒和咽喉炎，某些血清型可致成人腹泻或胃肠炎疾病多为自限性，主要经飞沫传播目前尚无疫苗预防，也无特效药物治疗,冠状病毒 Coronavirus,SARS病毒的形态,病毒形态示意图,SARS病毒的形态,病毒形态电镜图,SAR
24、S病毒的形态,病毒群落示意图,SARS Genome,SARS症状,中国的SARS流行,SARS病毒,Phylogenetic analysis of genome(AY394850)of SARS-CoV WHU strain and other 46 isolates,SARS病毒WHU株基因组序列分析,完成了SARS病毒WHU株的全基因组测序工作，将SARS病毒WHU株的全基因组序列与世界各地其他47株SARS病毒的全基因组序列进行了比对，分析了SARS病毒在流行传播过程中早期，中期，晚期病毒基因组遗传变异规律,Distribution of mutations onSARS-CoV g
25、enomes,22 positions with mutation occurred on more than three genomes P gene with the highest variation rate Position(26477)with the highest mutation rate is located within the M gene,Virus Genes.2005.30(1)：93-102.,Role of viral proteins which induce expression of COX-2 by SARS-CoV,Screening Genes o
26、f SARS-CoV that Activate COX-2 Promoter 筛选基因,S,N,Ctrl,SARS-N activates COX-2 promoter and induces protein expression（N蛋白诱导COX-2表达）,Correct localization of SARS-N is important to stimulate COX-2 expression 蛋白正确定位是关键,IJ Biochem Cell Biol 2006.38(8),核定位信号,SARS-N activates IL-6 promoter and induces prot
27、ein expression（N蛋白诱导IL-6表达）,NF-kB but not C/EBP is involved in SARS-N induced IL-6 expression 只有NF-kB与N蛋白转录激活有关,SARS-N activates translocation of NF-kb and the localization of SARS-N is important for the induction of IL-6 核定位信号与核输出信号都很重要,Virology.2007 May 7,HEK293T COS-7 A549,COX-2 Expression Induced by Spike of SARS-CoV,anti-COX-2,anti-S,anti-actin,S Control PMA,S蛋白诱导COX-2表达,SARS-S 蛋白诱导COX-2表达,FASEB J 2007;21(7):1586-1596,The End,期末考试,一、选择题，60分，每题一分二、问答题，40分，每题10分 基础类，综合类，实验设计类,
