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1、,第三章,灭菌技术问题,本章主要内容,灭菌原理与技术简介培养基制备与灭菌空气灭菌流程与设备反应器相关灭菌技术,生化反应过程多为纯培养过程，必需对生产的过程进行灭菌处理，其实质是对有害微生物的控制和消除。,第一节 灭菌原理与技术简介,第一节 灭菌原理与技术简介,消毒(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生物的方法,灭菌（sterilition）：杀死物体上全部微生物的方法,防腐(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生长的方法,几个基本概念,化疗(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖,控制微生物
2、的物理因素,高温灭菌辐射作用高渗作用干燥超声波,控制微生物的化学因素,表面消毒剂化学治疗剂,高温灭菌,多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65 10 min可以致死。一般噬菌体6580 致死；放线菌、霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，7680 10min可以杀死；细菌芽孢，在100 下20min才能致死；同种微生物老龄菌比幼菌耐热。,灭菌方法：湿热灭菌（mosist heat sterilization）干热灭菌（dry heat sterilization）,该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水50，蛋白质凝固温度为56；含水蛋白质凝固温度为160-170,湿
3、热灭菌(mosist heat sterilization),煮沸灭菌法（煮沸消毒法）,高压蒸汽灭菌法,巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）,高压蒸汽灭菌,是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度121）处理1530min。实验室中是培养基灭菌的最常用方法。工业中利用饱和蒸汽进行培养基和设备、管道等的灭菌。,就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障而死亡。,低温维持法,高温瞬时灭菌,巴氏消毒法(pasteurization),是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。具体做法是
4、61.762.8处理30min或71.6度处理15min，这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可保留食品饮料原有用味。根据结核杆菌在62下15min被致死。,紫外线,杀菌机制：诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰了核酸的复制,常用于实验室环境的灭菌，以物品表面的灭菌,各种微生物对紫外线抗性不同,干细胞强于湿细胞；芽孢，孢子强于营养细胞；多倍体二倍体单倍体,有机化合物,甲醛：纯甲醛为气体，3740水液为福尔马林。,醇是脱水剂蛋白质变性剂,70乙醇杀菌效果最好。,酚：35的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液。,K2MnO4使菌体蛋白质氧化，使酶失
5、活。013浓度可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。,第二节 培养基的制备与灭菌,培养基的配置培养基的灭菌,（一）培养基的配置,一、碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分。,提供合成目的产物所必须的碳成分,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,二、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 Na
6、NO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,2、有机氮源,来源：工业上常用有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、酒糟等。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无
7、机 盐及生长因子。,例 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例：蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题,三、无机盐的微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定,例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的
8、形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，PH对酶活的影响 pH 酶活不加 4.25 120分钟加 K2HPO4 5.45 30分钟加 KH2PO4 4.62 75分钟,使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑,四、生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维
9、生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率,3、产物促进剂,所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚
10、，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,五、水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,第二节 培养基的灭菌,主要采用高温湿热灭菌的方法。,如何确定灭菌条件？它的理论基础是什么
11、？,1.微生物的受热死亡动力学(对数残存律）,培养基灭菌的依据：杀死细菌的芽孢。,微生物的死亡速率遵循一级衰减率，可用下式描述：,式中：N是活菌体浓度，个数/ml或g/ml;k比死亡速率常数，min-1;t时间，min。,上式积分得到：,k值越小，表面微生物越不易热死，反之越易热死。,温度对死亡速率的影响,死亡速率常数k与温度的关系，可用阿累尼乌斯公式表达：,式中：A常数，min1l;E死亡活化能，J/mol;R气体常数，8.314J/mol K;T绝对温度，K。,上式微分可得：,在同样的温度变化下，死亡活化能越大的物质，它的死亡速率变化也越大。（对温度变化敏感）,微生物受热死亡的活化能，一般
12、要比营养成分热分解的活化能大得多。所以，当温度升高时，微生物死亡速率的增加，要比营养成分破坏速率的增加大得多。在较高温度下可以通过缩短灭菌时间而减少营养成分的损失，这是高温瞬时灭菌法的理论基础。,间歇灭菌,2.培养基间歇灭菌,又称分批灭菌，是将配制好的培养基和所有设备一起进行灭菌的操作，也称实罐灭菌。,特点是不需其他的附属设备，操作简便，国内外常用。缺点是加热和冷却时间较长，营养成分有损失，罐利用低。为中小型生产企业采用。,分批灭菌过程 升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。,Ln(N1/N2),要求绝对的无菌在工业
13、上很难做到，因为由对数残存律可知：,N=0，t=。因此，绝对的无菌很难做到。设计中常采用N0.001（1000次灭菌中有一次失败）,间歇灭菌的升温阶段和降温阶段对灭菌的贡献相对较小，而对培养基中维生素类物质的破坏作用则可能很严重。应尽量缩短提温和降温阶段。生产中一般采取121维持30min的方法。,3.培养基连续灭菌,连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度并能很快被冷却，因此，与分批灭菌相比，可在更高的温度下灭菌，而保温时间则很短，有利于减少营养物质的破坏。,其它常用的除菌方法,膜过滤除菌 是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是
14、由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。,此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。,第三节 空气的灭菌,需氧微生物在发酵过程中需要耗用氧气，氧气通常由空气提供。因此，在纯培养过程中，空气的除菌是需氧发酵的重要环节。,1.空气除菌的方法,热杀菌法 理论上讲，空气灭菌可以采用加热的方法。但空气用量很大，且空气
15、的传热效果较差。所以，用蒸汽加热灭菌是不合理的。,过滤除菌法 是让含菌空气通过过滤介质，以阻截所含的微生物，而获得无菌空气。该方法是工业中常用的方法。过滤除菌可分为绝对过滤和深层过滤。,其它方法 辐射法、化学法、静电除菌法。一般只限于实验室使用。,2.空气过滤除菌的原理,深层过滤所用的介质间歇一般大于固体颗粒。那么，空气中的菌体如何被除去呢？,是依靠气流通过滤层时，基于滤层纤维网格的层层阻碍，迫使气流不断改变气速大小和方向，使菌体与滤层纤维间发生惯性撞击、拦截滞留、布朗扩散、重力沉降和静电吸附等作用，来达到过滤除菌的目的。,3.空气过滤的对数穿透定律,空气过滤时，微粒在滤层内的减少速率，正比于
16、微粒的浓度，即：,式中：dN/dl通过单位滤层厚度时，菌体数的减少；k阻塞因数（1/cm或1/m）。,积分上式得：,4.常用的过滤介质,棉花,玻璃纤维,活性碳,超细玻璃纤维纸,烧结材料过滤介质,新型过滤介质 如超滤膜,5.空气过滤流程,a.高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程,特点：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到3035，第二级冷却至2025，经分水后加热到3035，因为温度升高，相对湿度下降。,b.冷热空气直接混合式空气除菌流程,特点：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、
17、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为3035，相对湿度为5060%。,第四节 工业相关灭菌技术,反应器的灭菌操作是生化反应过程重要的技术环节。灭菌不彻底会造成染菌，给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。,发酵反应器的灭菌染菌的防治,1.染菌的原因,从染菌的规模来分析染菌原因 大批发酵罐染菌：空气系统部分发酵罐(
18、或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的个别发酵罐连续染菌：设备问题(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。,从染菌的时间来分析发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理,从染菌的类型来分析耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌)：发酵罐的冷却管或夹套渗漏霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严
19、格,2.染菌的防治,种子带菌的防止 a.种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。b.把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。c.保证摇瓶间的清洁卫生;摇瓶内液体装料不宜过多;瓶口包扎的纱布一般为八层以上。,设备和管件的渗漏 一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。,死角 所谓死角是指灭
20、菌时因某些原因使灭菌温度达不到或不易达到的局部地区。发酵罐及其管路如有死角存在，则死角内潜伏的杂菌不易杀死，会造成连续染菌，影响生产的正常进行。,3.染菌后的挽救,种子培养或种子罐中发现污染。发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。,有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般可以采取以下措施：连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份(杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热至80C，存放处理4小时，以减少带入培养液中的杂菌数。对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理。甲醛用量每立方米罐的体积0.120.17升。对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌，灭菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。,The End,掌 握,常见灭菌方法和原理试验室和工业发酵操作染菌的防治,
