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1、第四节 无菌检查与染菌的处理,2、造成发酵染菌的可能途径有哪些？,1、什么叫发酵染菌?,3、染菌会对发酵工业造成哪些不良影响？,4、在现有科学条件下能否做到彻底不染菌？,据报道，国外抗生素发酵平均染菌率为2%-5%，国内的青霉素发酵染菌率2%，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率约为5%，谷氨酸发酵噬菌体感染率1-2%。,细短产气杆菌细短杆菌、假单孢杆菌双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌噬菌体青霉菌,不同杂菌的种类对发酵的影响,一、染菌隐患的检查,显微镜检查法,染菌隐患的检查,肉汤培养法 酚红肉汤培养基,染菌隐患的检查,平板划线培养或斜面培养检查法以平板划线和肉汤培养结果为主要根据要定期取样，取样时防止外
2、界杂菌混入,倒平板,空培养,待测样品划线,培养观察,注意事项,2、无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。,3、无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。,回,1、无菌试验时，如果连续3个时间的肉汤发生变色反应或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。,染菌隐患的检查,发酵过程的异常现象观察法溶氧异常排气中的CO2异常变化,杂菌是好气性微生物，溶解氧在较短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。,杂菌污染时，糖耗加快，
3、CO2含量含量增加；噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。,还可以根据其他的一些异常现象，如菌体生长不良、PH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。,其它异常现象,回,染菌率的统计 以发酵罐染菌批(次)为基准，染菌罐批(次)应包括染菌重消后的重复染菌批(次)在内。整个发酵周期中，无论前期或后期染菌，均作“染菌”论处。染菌率()=发酵(罐)染菌批(次)总数罐批(次)*100%,二、发酵染菌的原因,对整个发酵过程的危害极大。,严重干扰生产菌的生长繁殖。,干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。,影响相对
4、较小。,不同生产阶段染菌对发酵的影响,种子培养期染菌,发酵后期染菌,发酵前期染菌,发酵中期染菌,将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。,使发酵大面积染菌。,一般不具延续性，使单个（批）发酵罐发酵失败。,染菌几率较大。,不同染菌原因对发酵的影响,种子带菌,设备渗漏,空气带菌,培养基或设备灭菌不彻底,染菌原因的分析,国外一发酵工厂的染菌原因分析,染菌原因的分析,国内一发酵企业染菌的原因分析,a.从染菌的规模来分析染菌原因 大批发酵罐染菌：空气系统部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或消沫剂管路系统发生问题所造成的个别发酵罐连续染菌：设备问题
5、(如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备及管路灭菌死角个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。,b.从染菌的时间来分析发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理,c.从染菌的类型来分析耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底球菌、酵母：空气净化系统、冷却系统霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格,三、杂菌污染后的挽救和处理,种子培养期染菌的处理,种子罐染菌,备用种子,有,杂菌污染后的挽救和处理,发酵前期染菌的处理,终止发酵，重新灭菌再接入种子进行发酵,放掉部分料液，加入新鲜料液，重新灭菌再接入种子进行发酵,杂菌污染后的挽救和
6、处理,发酵中后期染菌的处理,适当加入杀菌剂或降低温度、控制补料量。,产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐,加热至0，保持30分钟后排放,杂菌污染后的挽救和处理,染菌后对设备的处理加热灭菌至120以上、保持30min后才能使用甲醛熏蒸或溶液浸泡12h以上处理,四、预防噬菌体的危害,利用细菌或放线菌进行的发酵容易感染噬菌体噬菌体直径约0.1微米，可以通过细菌过滤器，所以通用的空气过滤器不易将其除去。引起原因：设备的渗漏空气系统、培养基灭菌不彻底,噬菌体的防治措施,加入噬菌体抑制剂将培养液重新灭菌再接种（噬菌体不耐热，经分钟即可杀死）。补入适量的未感染噬菌体的发酵液 或促使菌种生长的生长因子，
7、抑制噬菌体的生长。,五、防止染菌的要点,（一）强化空气净化过程1空气净化流程的选择2过滤介质的选择3过滤介质的填装4空气净化系统的管理,（二）原料的预处理1原料除杂：防止机械受磨损2粉碎：减少固体的团块3浸泡：使营养物质便于菌体的利用4糊化、和糖化：大分子物质分解为小分子物质，易于菌体利用,饱和蒸汽，严格控制含水量稳定蒸汽压力，保证灭菌质量活蒸汽灭菌,（三）对蒸汽的要求,定时检查设备的渗漏对设备的死角要进行处理,（四）设备的灭菌,法兰连接死角,发酵工厂的有关管路要保持光滑、畅通、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会,渣滓在罐底形成的死角,培养基在罐底形成的膜层，有一定的绝热作用，容易形成死角。
8、,不锈钢衬里的死角,发酵液通过裂缝进入衬里和钢板之间，窝藏在那里形成死角。采用复合钢板制造发酵罐不产生死角,接种管路的死角,种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌是与发酵罐的灭菌同时进行的。应该在1处焊接上一个排气阀。,排气管的死角,罐顶排气管弯头处如有堆积物，其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭，而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染。排气管的直径太大，灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死。所以排气管不宜过大或过小。,不合理补料管配置造成的死角,不合理的补料管也容易造成死角,压力表安装不合理造成的死角,压力表安装不合理容易造成死角,定期检测发酵设备及管道,发酵设备的定
9、期检查1.搅拌系统转动有无异常2.机械密封是否严密3.罐内的螺丝是否松动4.罐内的管道有无堵塞5.罐体连接阀门是否严密发酵罐气密性的检查方法是维持温度不变，观察罐压是否恒定,管道、阀门的定期检查,管道容易因为各种原因发生渗漏导致染菌管道与阀门及主体设备的连接处、变径连接处、与管件的连接处由于热胀冷缩、物料腐蚀等作用容易发生渗漏检查方法：在管路系统中压入碱液，然后在可疑的地方用浸渍酚酞的白布拭擦，如出现红色，则为渗漏点。,阀门的渗漏,发酵设备中使用最多的附属设备是阀门，其中使用最多的是截止阀。阀心轧坏填料的渗透,(五）无菌室接种、移种等无菌操作必须在无菌室内进行要求：把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30min，然后倒置培养，长出的菌落应该在3个以下为好。,灭菌锅,培养种子及小型实验用具的灭菌操作时候要注意排气管是否畅通要保持较长时间的排气,原因分析,1、灭菌时由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”。2、产生泡沫发泡严重时泡沫可上升至罐顶甚至逃逸，以致泡沫顶罐。3、连续灭菌过程中，培养基灭菌的温度及其停留时间没有符合灭菌的要求。4、蒸汽不畅通。5、无菌检测不严格,六、对工艺操作的要求,
