《甾体激素》PPT课件.ppt

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1、第十五章 甾体激素类药物的分析The analysis of Steroid Hormon Drugs,刘红菊,基本结构：环戊烷骈多氢菲,4,5,6,7,第一节 基本结构与分类,4,1,4,5,5(10),环上双键的表示方法 双键位置,环上取代基构型表示方法,与母核相连的基团在环平面之后的，用虚线表示，称为构型。在环平面之前用的实线表示，称为构型。,构型,构型,11,17,4-3-酮,分类,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,皮质酮的衍生物,1肾上腺皮质激素,皮质酮,11,-醇酮基,4-3-酮,天然的皮质激素,氢化可的松Hydrocortisone,可的松

2、 Cortisone,地塞米松 dexamethason,合成的皮质激素,醋酸地塞米松,合成的皮质激素,地塞米松磷酸钠,醋酸曲安奈德,结构特点：,A环：脂肪环，具有4-3-酮结构。17位：-醇酮基。11位：羟基、羰基等。9位引入卤素,2.雄性激素及蛋白同化激素,睾酮的衍生物,睾 酮Testosterone,丙酸睾酮,雄性激素代表药物,苯丙酸诺龙,蛋白同化激素,结构特点：,A环：4-3-酮；17位：羟基、酯,可供分析的官能团：A环：4-3-酮,黄体酮Progesterone,3.孕 激 素,甲酮基,醋酸甲地孕酮,乙酰氧基,A环有4-3-酮结构；第10位无甲基；第17位有羟基和乙炔基。,炔诺酮,A

3、环的4-3-酮 17位上的甲酮基或乙炔基,可供分析官能团：,米非司酮,显碱性，可用非水溶液滴定法测定含量,4.雌 激 素,炔雌醇Ethinylestradiol,雌二醇Estradiol,A,A环的酚羟基C17 乙炔基,可供分析的官能团：,小 结,第二节 理化性质和鉴别试验,性状特征化学鉴别法紫外分光光度法,红外分光光度法薄层色谱法高效液相色谱法,一、性状特征,1.性状与溶解度：白色至微黄色粉末或结晶性粉末。在水中不溶，多数溶解于甲醇、氯仿等有机溶剂。2.熔点：纯度、鉴定；第一法3.比旋度4.吸收系数,二、化学鉴别法,（一）与强酸的呈色反应（母核）,甾体激素类药物,呈色,H2SO4 H3PO4

4、 HClO4 HCl硫酸-乙醇（甲醇）,与硫酸显色反应,药物 显 色 荧光 加水稀释,泼尼松龙 深红 絮状 灰,炔雌醇 橙红 黄绿 絮状玫红,醋酸可的松 黄或微 褪色并澄清 带橙色,氢化可的松 鉴别,取本品约2mg，加硫酸2ml 使溶解，放置5 分钟，显棕黄色至红色，并显绿色荧光；将此溶液倾入10ml水中，即变成黄色至橙黄色，并微带绿色荧光，同时生成少量絮状沉淀。,用途,化学鉴别薄层色谱的显色剂 例如：“雌二醇缓释贴片”用硫酸无水乙醇（1：1）为显色剂,(二)官能团的反应,1.C17 醇酮基,肾上腺皮质激素类药物的特征反应。,具有还原性,肾上腺皮质激素 有色甲臜,肾上腺皮质激素 Ag,肾上腺皮

5、质激素 Cu2O,碱性酒石酸铜,氨制硝酸银,formazan,醋酸泼尼松 鉴别,取本品约1mg，加乙醇2ml 使溶解，加10氢氧化钠溶液2 滴与氯化三苯四氮唑试液1ml，即显红色。,甾酮类激素药物,呈色,羰基试剂酸性,2.C3酮基和C20酮基,反应通式,常用的羰基试剂：羟胺、苯肼、2,4-二硝基苯肼、异烟肼、氨基脲等。,羟胺,肟,苯肼,苯腙,氨基脲,缩氨基脲,异烟腙（黄色）,睾酮,黄体酮,异烟双腙（黄色）,氢化可的松 鉴别,取本品约0.1mg，加甲醇1ml 溶解后，加新制的硫酸苯肼试液8ml，在70加热15分钟，即显黄色。,黄体酮,蓝紫色,亚硝基铁 氰化钠,其他甾体,淡橙色或不显色,3.甲酮基

6、,孕激素（黄体酮）的特征反应,黄体酮,蓝紫色,黄体酮 鉴别,取本品约5mg，置小试管中，加甲醇0.2ml 溶解后，加亚硝基铁氰化钠的细粉约3mg、碳酸钠及醋酸铵各约50mg，摇匀，放置1030分钟，应显蓝紫色。,4.活泼亚甲基反应,羰基邻位的亚甲基叫活泼亚甲基。C3、C11、C20 C2、C12、C21 有立体障碍，不反应,可的松,C17 羰基 可反应的活泼亚甲基：C16,雌酮,活泼亚甲基反应,雌酮,间硝基苯,雌激素,红色偶 氮染料,重氮苯磺酸,5.酚羟基,雌激素专属反应,（偶合）,雌激素,FeCl3,有色络和物,雌二醇【鉴别】,【鉴别】取本品约2mg，加硫酸2ml溶解，有黄绿色荧光，加三氯化

7、铁试液2滴，呈草绿色，再加水稀释，则变为红色。,6.乙炔基,白色,炔诺酮,【鉴别】（1)取本品约l0mg，加乙醇lml溶解后，加硝酸银试液5-6滴，即生成白色沉淀。,有机氟,氟,7.有机卤素,氧瓶燃烧,环-氯,氯,Cl,白色沉淀,硝酸,硝酸银,侧链-氯,加热,丙酸倍氯米松 鉴别,取本品约25mg，照氧瓶燃烧法（附录 C）进行有机破坏，以水20 ml与0.4氢氧化钠溶液1ml为吸收液，燃烧完全后，溶液显氯化物的鉴别反应。,环-氯,丙酸氯倍他索 鉴别,取本品少许，加乙醇1ml，混合，置水浴上加热2 分钟，加硝酸(1 2)2ml，摇匀，加硝酸银试液数滴，即显白色沉淀。,侧链-氯,8.酯的反应 C17

8、或C21位上羟基的酯，水解产生相应的羧酸，再根据羧酸的性质进行鉴别。如：,香,特臭,特臭,-3-酮,苯环,四、UV法,中国药典规定雌二醇的紫外鉴别方法：“取含量测定项下溶液，照分光光度法（附录 A）测定，在280 nm 的波长处有最大吸收。”,丙酸倍氯米松 鉴别,取本品，精密称定，加乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含20g 的溶液，照分光光度法（附录 A）测定，在239nm的波长处有最大吸收，吸收度为0.570.60；在239nm与263nm波长处的吸收度比值应为2.252.45。,33003000cm-1,30002700cm-1,19001650cm-1,16501450cm-1,五、IR

9、法,37503300cm-1,醋酸可的松,结构特征：43酮、C20 酮基、C11 酮基、C17 OH、醋酸酯,1630cm-1,3420cm-,亚甲基、角甲基吸收带,1750cm-1,1232cm-1,1052cm-1,COH,六、TLC法,主要用于甾体激素类制剂的鉴别方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。,丙酸睾酮注射液的鉴别,固定相：硅胶GF254检视方法：254nm紫外灯下检视荧光淬灭的暗斑,七、HPLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,基本结构：环戊烷骈多氢菲

10、,4,5,6,7,第一节 基本结构与分类,小 结,化学鉴别法制备衍生物测定熔点紫外分光光度法,红外分光光度法薄层色谱法高效液相色谱法,第二节 鉴别试验,一、化学鉴别法,与强酸的呈色反应C17 醇酮基：还原性,肾上腺皮质激素 Cu2O,肾上腺皮质激素 Ag,肾上腺皮质激素 有色甲臜,酮基的呈色反应甲酮基 黄体酮亚硝基铁氰化钠 蓝紫色活泼次甲基反应 雌酮间硝基苯 紫红色酚羟基,甾酮类激素,呈色,羰基试剂,雌激素,FeCl3,有色络和物,乙炔基有机氟,雌激素,红色偶 氮染料,重氮苯磺酸,（偶合）,有机氟,有机氯酯的反应,氧瓶燃烧,环-氯,侧链-氯,加热,第三节 特殊杂质检查,一、有关物质1.定义 主

11、要包括合成起始物、中间体、副产物及降解产物等。,2.特点（1）可能存在多个甾体杂质（2）结构类似,3.方法（具有一定分离能力）TLC法 HPLC法,（1）TLC法,对照：自身稀释对照法判定方法：规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色深度,醋酸氟轻松 检查其他甾体,取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5l，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97:3）为展开剂，展开后晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以,碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液

12、的主斑点比较，不得更深。,1,2,特点：（1）简便易行，不需特殊的仪器；（2）不需对照品；（3）只能控制单个杂质的限量；（4）要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。,（2）HPLC法,对照：主成分自身对照法判定方法：规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml含2mg的溶液（1）与每1ml含0.04mg的溶液（2），分别取溶液（1）和溶液（2）各10l，进样。记录至主成分峰保留时间的2倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。,醋酸甲地孕酮 检查 其他甾体,特点：（1）不需对照品；（2）可

13、以控制杂质的总量；,剧毒,二、硒,来源：合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢。方法和原理：,pH2.00.2,醋酸氟轻松 检查 硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05g/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.0 0.2后，转移至分液漏斗中，用水少量分次,洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（12）1ml，摇匀后，立即精密加二氨基萘试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2min，静置分层，取环己烷脱水后，测A378n

14、m。规定 A供A对。,三、有机溶剂残留,GC法甲醇：第二类，限量0.3%丙酮：第三类，限量0.5%,地塞米松磷酸钠 检查 甲醇和丙酮,精密称取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加0.1%（ml/ml）正丙醇（内标）溶液2ml，加水稀释至刻度，作为供试液；另精密量取甲醇10l(7.9mg)与丙酮100l(79mg)置100ml量瓶中，精密加内标溶液20ml，加水至刻度，作为对照液。照气相色谱法测定，甲醇限量为0.3%，丙酮限量为0.5%。,四、游离磷酸,地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠,磷钼酸比色法（钼蓝法）：,740nm,磷钼酸,地塞米松磷酸钠 检查 游离磷酸,

15、精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液(0.035mg/ml磷酸二氢钾溶液)4.0 ml同法处理的吸收度比较，不得更大。,（对照液 0.035mg/ml KH2PO4）,第四节 含量测定,一、HPLC固定相：C18（ODS）流动相：甲醇水 或 乙腈水方法：外标法；内标法，以不同的甾体激素药物为内标。,黄体酮注射液【含量测定】,色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇水(65:35)为流动相；检

16、测波长为254nm。理论板数按黄体酮峰计算应不低于1000，黄体酮峰和内标物质峰的分离度应符合要求。内标：己烯雌酚。,另用内容量移液管精密量取本品适量（约相当于黄体酮50 mg），置50 ml量瓶中，用乙醚分数次洗涤移液管内壁，洗液并入量瓶中，加乙醚稀释至刻度，摇匀；精密量取5 ml 置具塞离心管中，在温水浴内使乙醚挥散；用甲醇振摇提取4 次（第1 3 次各5 ml，第4 次3 ml），每次振摇10分钟后 离心15分钟，并用滴管将甲醇液移置25 ml量瓶中，合并提取液，精密加入内标溶液5 ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀；取5 10 l 注入液相色谱仪。按内标法以峰面积计算，即 得。,地塞米松磷酸

17、钠 2000年版,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇0.34磷 酸二氢钾溶液(60:40)为流动相；检测波长为240nm。理论板数按地塞米松磷酸钠峰计 算，应不低于1250，地塞米松磷酸钠峰和内标物质峰的分离度应大于4.8。,地塞米松磷酸钠 2005年版,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；三乙胺溶液（取三乙胺7.5ml，加水至1000ml，用磷酸调节pH值为3.00.05）-甲醇乙腈(55:40：5)为流动相；检测波长为242nm。理论板数按地塞米松磷酸钠峰计 算，应不低于7000，地塞米松磷酸钠峰和内标物质峰的分离度应大于4.4。,二、UV

18、法,-3-酮 240nm（）,肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素,苯环 280nm（）,雌激素,醋酸地塞米松片,取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于醋酸地塞 米松7.5mg），置100ml 量瓶中，加乙醇75ml，置5060的水浴中保温10分钟，并时 时振摇使醋酸地塞米松溶解，放冷至室温，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取 续滤液20ml，置另一100ml 量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，照分光光度法（附录 A），在240nm的波长处测定吸收度，按C24H31FO6的吸收系数（1%1cm）为357计算，即得。,三、比色法,1.适用于非分光光度活性药物2.使待测组分光谱位

19、移，避免干扰3.增加测定灵敏度,弱、非分光光度活性药物,强分光光度活性药物,化学反应,C17-醇酮基,强还原性,（一）四氮唑比色法,皮质激素,1.原理,氯化三苯四氮唑：TTC，红四氮唑(BP，ChP),2.四氮唑盐的种类,蓝四氮唑：缩写为BT(USP),O,OH-,分子重排,三苯甲臜（深红),蓝四氮唑（BT）,双甲臜（暗蓝）,3.讨论,（1）基团对反应速度的影响,C11=O C11OH,C21OH C21-酯,C16无论何种取代基,（2）溶剂、水分的影响,含水量5%,含水10%A10%含水30%几无反应,无水乙醇,（3）碱的种类及加入顺序,反应应在强碱性(pH 13.75)条件下进行。以氢氧化

20、四甲基铵的结果最佳,加入顺序：,（4）氧与光线的影响,怕光,避光、快速,O2影响颜色强度和稳定性,隔绝空气、快速、充N2,（5）温度与时间,t甲臜分解,醋酸泼尼松龙乳膏 含量测定,对照液：略供试液：精密称取本品4 g（约相当于醋酸泼尼松龙 20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30 ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中放冷后，滤过，滤液置100 ml量瓶中，同法提取3次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。,【规格】(1)4g:0.02g(2)10g:0.05g,醋酸泼尼松龙乳膏 含量测定测定法：精密量取上述溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇

21、9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25暗处放置4045分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。操作应避光。,醋酸去氧皮质酮【含量测定】,取本品适量，精密称定，加无醛乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含35g的溶液，精密量取10ml，置25ml量瓶中，加氯化三苯四氮唑试液2ml，在氮气流下，迅速加入氢氧化四甲基铵试液2ml，通氮气后，密塞，摇匀，于30水浴中放置1小时，迅速冷却。用无醛乙醇稀释至刻度，摇匀，照紫外可见分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸光度。,1.原理,（二）异烟肼比色法,异烟腙（黄色）max约42

22、0nm,酸性,（1）溶剂的选择,异烟肼盐酸盐甲醇、乙醇,无水,2.讨论,(2)酸、异烟肼的量,盐酸:异烟肼=2:1样品:异烟肼=1:8,t 反应速度,(3)温度的影响,（4）反应专属性 C3酮基,反应速度C3=O C17=O C20=O C11=O 不反应,测定法：精密量取上述溶液（乙醇溶液）各10ml，分别置具塞容器中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿10ml，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液10ml，摇匀，置55暗处保温45分钟，取出，放冷，用氯仿稀释至25ml。摇匀，在415nm的波长处分别测定吸收度，计算即得。,醋酸地塞米松乳膏（2005年版）,max=520nm,雌激素

23、,（三）Kober反应比色法,雌二醇-3-甲醚,max=465,max=515,复方炔诺孕酮滴丸中的炔雌醇含量测定方法,测定法 精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml，分置具塞锥形瓶中，于冰浴中冷却30秒钟后，各精密加硫酸乙醇(4:1)8ml（速度必须一致），随加随振摇，加完后继续冷却30秒钟，取出，在室温放置20分钟，照分光光度法（附录 A），在 530nm 的波长处分别测定吸收度，计算，即得。,四、非水溶液滴定法,米非司酮 取本品0.3g，精密称定，加冰醋酸20ml溶解后，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白溶液校正。每1ml的高氯

24、酸滴定液（0.1mol/L）相当于42.96 mg的米非司酮（C29H35NO2）。,五、生物样品中甾体激素的分析,对分析方法的要求：专属性强，灵敏度高常用的分析方法：GC,HPLC,GC-MS,HPLC-MS,1、了解本类药物的分类，掌握其结构 特征与分析方法的关系。2、掌握某些官能团的呈色反应，了解其他鉴别方法。3、熟悉本类药物中其他甾体的检查方 法，熟悉其他特殊杂质的检查。,第十章 复习内容,4、掌握四氮唑比色法、异烟肼比色法、Kober反应比色法的原理、方法及测定条件。了解UV法及HPLC法在其含量测定中的应用。5.了解生物样品中甾体激素的分析,甾体激素类药物的结构中能和四氮唑盐发生显

25、色反应的基团 A.酚羟基 B.活泼次甲基 C.甲酮基 D.C17-醇酮基 E.酮基,用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是 A强酸性 B中性 C强碱性 D弱碱性 E以上都不对,A维生素B1 B醋酸地塞米松 C两者皆是 D两者皆不是1.异烟肼比色法 2.硫色素反应3.紫外分光光度法4.羟肟酸铁反应5.绿奎宁反应,B,A,C,D,D,可用于氢化可的松鉴别的试剂有 A氨制硝酸银 B异烟肼 C红四氮唑 D硫酸 E重氮苯磺酸,可用于甾体激体类药物的测定方 法有 A高效液相色谱法 B四氮唑盐法 C紫外分光光度法 D异烟肼比色法 EKober反应比色法,能与亚硝基铁氰化钠反应生成蓝紫色的药物是

26、 A雌二醇 B黄体酮 C醋酸可的松 D苯丙酸诺龙 E以上都不对,异烟肼比色法测定甾体激素类 药物时，药物的呈色基团是 A.酮基 B.酚羟基 C.活泼次甲基 D.炔基 E.甾体母核,四氮唑比色法可用于下列哪 个药物的含量测定 A.可的松 B.睾丸素 C.雌二醇 D.炔雌醇 E.黄体酮,可适用的药物：A.可的松 B.雌二醇 C.两者均可 D.两者均不可 1亚硝酸钠滴定法 2高效液相色谱法 3能与羰基试剂缩合 4可用四氮唑比色法测定 5.Cober反应比色法,D,C,A,A,B,黄体酮在酸性溶液中可与下列哪些试剂反应呈色 A.2,4-二硝基苯肼 B.三氯化铁 C.硫酸苯肼 D.异烟肼 E.四氮唑盐,Kober反应适用于哪一药物的含量测定 A.黄体酮 B.雌二醇 C.甲基睾丸素 D.甲基炔诺酮 E.氢化可的松,用四氮唑比色法测定皮质激素类药物，是利用C17 醇酮基的何种性质 A氧化性 B还原性 C可加成性 D酸性 E碱性,可与重氮苯磺酸作用生成红色偶氮染料的甾体激素类药物是 A.醋酸可的松 B.睾酮 C.黄体酮 D.雌二醇 E.炔诺酮,*,*,*,*,*,*,*,