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1、组织化学技术 江苏大学 基础医学与医学技术学院卢小东,组织化学的基本概念：组织化学：组织水平，对组织内存在的各种物质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法 免疫组织化学：基于抗原抗体反应 酶组织化学,疾病的病理学研究概括起来主要在基因和蛋白水平上进行的研究。免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平表达的研究。蛋白表达=分布，定位，定量；蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等,材料：抗体：多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。,显示物：酶标反应：碱性磷酸酶（Alka
2、tine phasphotase,AP）AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用，可形成不同颜色的终产物。用新品红（New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,)HRP：底物为DAB四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。,HRP,AP,HE,荧光标记：荧光素标记抗体异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale,FITC）520530nm四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata,TRITC）620nm四乙
3、基罗达明（Teraethyle rhodamine B200,RB200）590600nm,胶体金：指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，免疫电镜观察,主要方法：直接法：间接法：经过了第二抗体放大效应PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。,ABC法：生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。,S-P法（LSAB）：
4、采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。,Envision法（二步法）：原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。,以LSAB法为例简单介绍染色步骤：石蜡切片脱蜡水；3%H202抑制内源性过氧化物酶15min；每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育5min；加特异性一抗，370C孵
5、育3060min，or 40C过夜；加20ul生物素标记的第二抗体，370C，30min；,加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，370C，30min；以上每步后均用PBS液洗33min；用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色515min。在光镜下观察。自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝，梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。,免疫组化常见问题的处理：组织材料的处理：固定液为：10%中性福尔马林液；4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；固定时间：8-24hr 组织大小：2*1.5*0.3cm,防脱片处理：多聚-L-赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。,增强特异性染色的措施和方法：1）蛋白酶消化：a
6、、胰蛋白酶消化（0.05-0.1%）；b、胃蛋白酶消化（0.4%）。2）热诱导的抗原修复：方法：微波960C,10min；直接加温方法 1000C,10min；高压锅 1200C,10min；热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液,合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；浓缩型。,减少或消除非特异性染色的方法：非特异性染色：原因：方法：,对照：阳性对照：用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。阴性对照：用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照
7、等，用以排除假阳性结果。,免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。,阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面 阳性细胞分布：灶性；弥漫性 染色强度不一 切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。对于阳性结果的定量判断：-，+，+，+等分级和计数统计,垂体腺瘤 ACTH,乳腺癌 c-
8、erbB-2,免疫组化,A细胞,B细胞,D细胞,上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）：广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮，胰腺以及绝大部分内脏癌。前列腺特异性抗原（PSA）：甲胎蛋白（AFP）：甲状腺球蛋白（Tg）：,软组织标记 软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中 肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种 可溶性蛋白，具有较高组织特异性。,内皮细胞标记CD34：主要标记内皮细胞；亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。第八因子相关抗原（Factor-
9、related antigen,F-RAg）：血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。CD34优于F-RAg。溶菌酶（Lysozyme）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。抗胰糜蛋白酶（AAcT）：主要用于恶纤组的诊断。,淋巴细胞标记物：白细胞共同抗原（LCA,CD45）：主要分布于T,B细胞，单核细胞，粒细胞表面。CD20：B细胞标记物。CD45RO、CD3：T细胞标记物。CD57：为自然杀伤细胞的标记物。CD38：为浆细胞的标记物。CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。,神经内分泌标记物：嗜铬素A（Chromogranin,CgA）：存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。突触素（Synaptophy
10、sin,Sy）：存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞，神经内分泌细胞中。髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein,MBP）：,激素及激素受体类标记：雄激素受体（Androgen receptor,AR）：雌激素受体（Estrogen receptor,ER）孕激素受体（Progesterone receptor,PR）：垂体激素：ACTH,GH,PRL,LH,TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。降钙素（Calcitotin,CT）：甲状腺旁细胞（C细胞）分泌。,以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断 其联合应用的作用和意义：Keratin Vimentin 上皮
11、性肿瘤 Keratin 滑膜肿瘤 Vimentin 间皮肿瘤 上皮样肉瘤 癌肉瘤,Desor Actin 肌源性肿瘤 CD34or F 血管性肿瘤 Keratin S-100or MBP 神经鞘膜瘤Vimentin LCA 淋巴细胞 AACT 骨肿瘤、纤维组织细胞肿瘤 GFAP 胶质细胞肿瘤 Keratin NSEor Sy Vimentin NF 节细胞神经母细胞瘤,免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则：免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的 形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。免疫组化用于判断组织起源，
12、分型，预后的估计。免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为准。,涂片,磨片,骨bone,电子显微镜技术：透射电镜,透射电镜,扫描电镜,电子显微镜技术,透射电镜,扫描电镜,固定：为了尽量保存样本的原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇酸来染色。冷固定：将样本放在液态的乙烷中速冻，这样水不会结晶，而形成非晶体的脱干：使用乙醇和丙酮来取代水。包埋：树脂超薄切片：将样本使用金刚石刃切成薄片。染色：重的原子如铅或铀比轻的原子散射电子的能力高，因此可被用来提高对比度。,名词解释：分辨率 免疫组织化学技术 HE染色问答题：1.石蜡切片主要经过哪些步骤？2.列举观察组织器官细微结构的染色方法，并说明其优缺点,
