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1、病毒的检测,内容提要,病毒的分离与鉴定病毒感染单位的测定病毒颗粒的检测病毒的血清学检测病毒核酸的检测,病毒的分离与鉴定,病料的采集与准备病毒的分离与培养病毒的理化特性测定病毒的血清学与分子生物学鉴定,大多数革兰氏阳性菌都对青霉素敏感（结核杆菌对青霉素不敏感）；而革兰氏阴性菌则对青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中的流行性脑膜炎双球菌和淋病双球菌对青霉素敏感），而对链霉素、氯霉素等敏感。所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大。,病料的采集与准备,病料采集部位需适当一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等，采样因动物及病毒的种类而异。犬细小病毒或轮状病毒腹泻的幼犬或犊
2、牛:粪便 口蹄疫的猪或牛:水泡液及水泡皮 流感病毒:拭子 肺脏,病料采集后处理需适当采集的器官或组织样本如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等，可取一小块进行充分研磨，加入含青、链霉素的Hanks液，离心取上清液作为接种物；,分泌物或渗出液、粪便拭子取样,鼻液、脓汁、乳液汁等分泌物或渗出液、粪便，应加入高浓度的抗生素，充分混匀后，置4度冰箱内处理24小时或过夜，离心后取上清作接种用；拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%犊牛血清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中，充分涮洗棉拭子，反复冻融35次，离心后取上清液作为接种材料。,病毒的分离与培养,病毒是严格细胞内寄生的生物，所以病毒的培养需要在活体内进行。
3、细胞培养、鸡胚和实验动物原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系,细胞培养相关知识,病毒严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。实验动物、鸡胚都拥有大量活的细胞，可用于病毒培养。尤其是SPF动物或SPF鸡胚，目前仍然经常供培养病毒之用，但是发展最快的技术是细胞培养。,动物细胞培养一般流程,原代细胞（primary cell）对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。二倍体细胞株（diploid cell strain）将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。传代细胞系（established cell line）来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色
4、体数目不正常，为异倍体。HeLa（人子宫癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、BHK-21（乳仓鼠肾细胞）、PK-15（猪肾细胞）等，并有专门机构负责鉴定和保管，如ATCC等,细胞培养的类型,细胞培养所需要的一般器材,一般营养要求及培养条件,培养基：状态:液体培养液（动物细胞生活的液体环境）成分:葡萄糖（满足能量需求、作为细胞碳源）氨基酸（合成蛋白质）无机盐（重要的细胞组成物质）维生素、动物血清等（生长调节作用）条件:恒温（动物细胞生长温度）无菌条件（防止微生物污染）一般还需要一定浓度的二氧化碳,血清的作用：,（1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。（
5、2）提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。（3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。（4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。（5）提供 PH 缓冲物质，调节培养基PH。（6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。,细胞培养的方法,静置培养（stationary culture）封闭，静置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。旋转培养（roller culture）不同之处是要培养的细胞不是静置，而是使之不断缓慢旋转（
6、510r/h），经过一段时间，细胞可在培养瓶（管）的四壁长满单层。,悬浮培养（suspensive culture）通过搅拌使细胞处于悬浮状态生长或维持存活。此法适用于某些不需要贴壁生长的细胞系，如NS-1（一种骨髓瘤细胞系），或作某种特殊研究之用。微载体培养（micro-carrier culture）是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。微载体是直径10035m的微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，虽则增高了生产成本。,细胞培养应用范畴,（1）生产有重要价值的蛋白质产品分泌
7、性的蛋白质产品（2）培养皮肤细胞用于移植形成组织（3）检测有毒物质致癌致畸引起染色体目和结构改变（4）理论研究:培养正常或异常细胞用于生理、病理、药 理研究(5)病毒的分离鉴定,应用举例,病毒对细胞的选择性猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或二倍体细胞等培养。PRRSV仅在猪肺巨噬细胞、Marc-145细胞及非洲绿猴肾细胞系MA-104生长 PCV常用PK15细胞培养,培养方法常用的有静置培养和旋转培养，旋转培养产率更高大部分的病毒以静置培养为主如轮状病毒，初次分离时旋转培养成功率较静置培养为高。,SARS-CoV in various cell lines,RD,293,HeLa,
8、A:正常A72细胞(A72);B:CCV感染后，导致的合胞体细胞(a)及凋亡现象(b),A,a,b,B,图3426-1 鸡胚接种途径示意图（据Flint等）,鸡胚,依据不同的病毒种类，选择适当的接种途径，通常接种尿囊腔，如新城疫病毒等。特殊情况可接种包括卵黄囊、绒毛尿囊膜和羊膜腔等，如鸡痘病毒接种绒尿膜。,实验动物,病毒的理化特性测定,病毒核酸型鉴定是病毒理化特性测定的最主要指标。代谢抑制法，即添加氟脱氧尿核苷（FUDR）病毒复制被抑制者，即为DNA病毒，否则为RNA病毒。DNA酶或RNA酶分别作用，以判定核酸的性质。绿豆芽酶（Mung bean nuclease）可降解单股核酸，用它可进一步
9、鉴定核酸是单股或双股。直接用纯化的病毒核酸通过电子显微镜观察PCR核酸测序技术,脂溶性试验,用乙醚或氯仿处理待检病毒液，而后与未处理者比较其TCID50的变化，以判断是否敏感,从而判定是否为有囊膜病毒,空斑试验,病毒样本接种吸附于单层细胞细胞上覆盖一层含营养液的琼脂感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞形成空斑或蚀斑（plaque）,空斑形成单位（PFU）仅计数含20-100个空斑的培养板。,Virus Plaques,终点稀释法,终点稀释法（Endpoint dilution assay）用于测定几乎所有种类的病毒滴度，包括某些不能形成空斑的病毒，并可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。使用细胞培养
10、，可通过CPE来判定组织培养半数感染量（TCID50）。,病毒颗粒的检测,电子显微镜技术,最直观的方法是用电子显微镜（Electron microscopy，EM）观察病毒颗粒。,电子显微镜观察法 可放大数十万倍，能观察1nm的微粒。,一些含毒量高的病毒样本，如粪样、鼻拭子浸液或组织匀浆液，可用EM检出病毒。可用磷钨酸盐等重金属盐直接作负染而后观察，器官组织样本则须作超薄切片后再作负染观察。前者适用于观察病毒的表面结构如口疮病毒等，后者则可观察细胞内的病毒结构，如冠状病毒、反录病毒在组织中出芽的病毒颗粒等。,血凝试验（Hemagglutination assay）,许多动物病毒，如正黏病毒科、
11、副黏病毒科、腺病毒科的成员，能够凝集某些种类动物（如鸡、小鼠、豚鼠、人）的红细胞。这些病毒含有可与红细胞结合的蛋白质，如禽流感病毒的囊膜上有一种称为血凝素的糖蛋白，可与红细胞表面的N乙酰神经氨酸糖蛋白结合，引起红细胞凝集。利用这种特性，可作血凝试验来检测这些病毒的存在。,一般将病毒液在血凝反应板上作倍比稀释，加入红细胞未凝集的红细胞呈圆点或纽扣状沉于孔底 凝集的红细胞弥漫性格状复盖整个孔,血凝试验,血凝抑制试验,血清学检测,病毒中和试验（Virus neutralization）,针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感染性。病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上
12、进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性。终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。中和试验具有很强的特异性，是检测病毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体。,补体结合试验（Complement fixation）,补体结合试验可以用于检测动物血清中的病毒抗体。病毒抗原与抗体的相互反应可以引起补体结合，最终可导致膜溶解。在补体结合试验中，利用红细胞作为靶细胞，溶血系统作为指示系统，因红细胞膜的溶解易于观察到。如果存在抗体抗体结合反应，补体结合将发生，后者利用加入结合红细胞
13、抗体（溶血素）的绵羊红细胞可以检测到。如果补体被病毒抗原抗体复合物结合，则红细胞仍然是完整的；相反，如果补体未被结合，红细胞将在游离的补体的作用下被溶解。,酶联免疫吸附试验（ELISA）,酶联免疫吸附试验可用于样本中病毒的检测和动物血清中病毒特异性抗体的检测，检测病毒抗原可采用夹心法和双夹心法，检测抗体可采用间接法。,病毒核酸的检测,聚合酶链式反应,原理:设计PCR引物，检测目的片段的大小，DNA测序，比对已知病毒序列。PCR可直接用于DNA病毒的检测，如果是RNA病毒，则需在扩增之前进行反转录，即提取病毒RNA，加入反转录酶合成cDNA后，再进行PCR扩增，称为RT-PCR,M,1,2,3,
14、4,6,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,bp,750,RT-PCR,主要适用于RNA病毒的检测也可用于对DNA病毒等的转录水平的检测,核酸杂交,核酸杂交（Nucleic acid hybridization）包括DNA杂交和RNA杂交。前者即Southern blot hybridization，用于检测病毒DNA。RNA杂交 即Northern blot hybridization，用于病毒RNA的检测，基本过程与DNA杂交相似。核酸杂交技术可用于细胞、组织中病毒基因组或转录本的定位检测，即称为原位杂交（in situ hybridiz
15、ation）。,DNA样本经限制性内切酶消化，凝胶电泳，变性，转移到滤膜上，然后用放射性同位素标记的病毒核酸序列探针检测结合到固相滤膜上的DNA。目前放射性同位素标记的核酸探针很少使用，而大多用非放射性标记探针（如生物素标记）进行检测。一种改良的方法，称为斑点杂交，可用于样本中病毒核酸的快速检测。Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解。Souther
16、n blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western blot是分析蛋白质的。,Sorthern Blot,探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。,DNA芯片（DNA microarray chip）,是一类新型的分子生物学技术。该技术是将病毒DNA片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而可检测样品中靶分子的数量。病毒DNA片段有序地固化与已标记的待测样品中靶分子杂交对杂交信号的强度进行分析检测样品中靶分子的数量。,谢谢,
