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1、真菌毒素检测技术,第三章,曾 实河南工业大学生物工程学院微生物系微生物学教研室联系电话：67789926（2023年7月20日,概 述,一、真菌毒素的定义二、真菌毒素的种类三、真菌毒素中毒症及其特点 四、真菌毒素的研究历史五、粮油食品中主要的真菌毒素,一、真菌毒素的定义,真菌毒素(Mycotoxin)是真菌产生的一类有毒次生代谢产物。真菌：？真菌的种类与粮食储藏相关的真菌次生代谢产物？初生代谢及初生代谢产物次生代谢及次生代谢产物,二、真菌毒素的种类,至今已发现300多种化学结构不同的真菌毒素 根据真菌毒素作用的靶器官，可分为五类肝脏毒肾脏毒神经毒光过敏性皮炎毒其他毒等,真菌毒素中毒症的定义 人
2、、畜禽食用被真菌毒素污染的食品或饲料后发生的中毒现象，称为真菌毒素中毒症(Mycotoxicoses)。真菌毒素中毒症的特点 中毒与某些食物有联系中毒发生有季节性和地区性机体对真菌毒素不能产生抗体，也不能免疫,三、真菌毒素中毒症及其特点,四、真菌毒素研究的发展简史,起始于黄变米事件火鸡X事件,TOM SAYS:I want a girlfriend,五、真菌毒素研究的主要内容,粮油食品上真菌毒素的种类真菌毒素污染粮油食品的因素各种真菌毒素的毒性真菌毒素检测技术真菌毒素脱毒技术,第一节 粮食中主要真菌毒素及其特点,一、黄曲霉毒素（Aflatoxins）二、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynival
3、enol,DON）三、赭(棕)曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA或OA）四、玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN(F-2)）,一、黄曲霉毒素(Aflatoxin，简称AFT或AF),（一）黄曲霉毒素的种类和结构 目前已发现的黄曲霉毒素有AFBl、AFB2、AFG1、AFG2、AFB2a、AFG2a、AFM1、AFM2、AFPl等二十种左右基本结构是一个双氢呋喃和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。,图3-1-1 食品中常见的AFT化学结构式,（二）黄曲霉毒素的理化性质 一般特性：几乎是无色，B1的分子量为312，熔点为268269 荧光特点：黄曲霉毒素在 365毫微米波长紫外照射下可产
4、生荧光，B族毒素显蓝紫色荧光；G族毒素显黄绿色荧光 溶解特性：难溶于水、己烷，石油醚和乙醚；易溶于氯仿、甲醇、丙酮、苯、乙腈等多种有机溶剂,一、黄曲霉毒素（AFT）,一、黄曲霉毒素（AFT）,稳定性对热稳定，分解温度300 中性和酸性溶液中很稳定，在强碱(pH9-10)溶液中可被迅速分解 5的次氯酸钠溶液可瞬时破坏毒素有很高的储藏稳定性,（三）黄曲霉毒素的毒性 急性毒性:对动物毒害作用的靶器官主要是肝脏，可引起肝实质细胞坏死，胆管上皮增生，肝出血等病变；一日龄鸭雏的致死中量(LD50)为364g/kg,而小白鼠的LD50为57mg/kg。慢性毒性：动物肝脏出现亚急性或慢性损伤，引起肝脏纤维细胞
5、增生，肝硬化；动物表现生长发育缓慢、体重减轻等生长障碍现象,一、黄曲霉毒素（AFT）,致癌性 可诱发所有实验动物致癌诱发动物肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍 黄曲霉毒素可在动物体内代谢，进行脱甲基、羟化和环氧化反应，形成具有强致癌活性的物质,一、黄曲霉毒素（AFT）,（四）黄曲霉毒素的产毒条件 产毒微生物 黄曲霉：6094菌株产毒 寄生曲霉：产毒菌株可达100产毒的基质 玉米、花生容易滋长黄曲霉和被黄曲霉毒素污染 有时可在田间被黄曲霉毒素污染,一、黄曲霉毒素（AFT）,产毒的环境条件生长温度范围一般为1242，最适生长温度为33最低生长水活度（aw）为0.78，最适aw为0.930.98最适产
6、毒温度一般在2428之间随着分生孢子的形成而开始产毒,一、黄曲霉毒素（AFT）,（五）食品和饲料中黄曲霉毒素的允许残留标准 允许残留量（g/kg）玉米、花生仁、花生油 20玉米及花生仁制品（按原料折算）20 大米、其它食用油 10 其它粮食、豆类、发酵食品 5婴儿代乳品 不得检出,一、黄曲霉毒素（AFT）,（六）黄曲霉毒素的脱毒 脱毒要求能保持被处理物的原有品质属性确保去毒彻底，无可逆性不引入新的有害物质或在处理过程中产生新的有害物质处理的成本必须远低于被处理物的价值方法简捷，处理量大,一、黄曲霉毒素（AFT）,常用脱毒方法吸附法活性炭、天然白土等用于油脂水合硅铝酸钠钾等用于饲料 碱炼法熏蒸法
7、,一、黄曲霉毒素（AFT）,一、黄曲霉毒素（AFT）,（七）黄曲霉毒素的检测方法 薄层层析法：检测灵敏度为5g/kg酶联免疫法,二、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，简称OTA或OA）,（一）赭曲霉毒素的种类和结构 目前已发现的赭曲霉毒素有A、B、C、D四种化合物，一个异香豆素和一个-苯基丙氨酸连接形成其基本化学结构。见后图：,赭曲霉毒素D是4-羟基赭曲霉毒素A,图3-1-2 赭曲霉毒素的化学结构式,（二）赭曲霉毒素A的理化性质 一般特性：OTA是无色的结晶化合物，分子式为 C20H12O6NCl，分子量为297。熔点为9496。溶解性：赭曲霉毒素A为酸性化合物，易溶于碱性溶液(如碳酸氢
8、钠溶液)及甲醇、氯仿等极性溶剂，不溶于己烷和石油醚，微溶于水。,二、赭曲霉毒素A（OTA）,（二）赭曲霉毒素A的理化性质 荧光特点：在254毫微米波长紫外照射下产生黄绿色荧光，在碱性条件下呈蓝紫色荧光稳定性：OTA纯品易受光和热的影响而分解，其乙醇溶液置低温避光可保存一年,二、赭曲霉毒素A（OTA）,（三）赭曲霉毒素的毒性对实验动物经口的LD50为3.430.3mg/kgbw。对动物毒害作用的靶器官主要是肾脏，可引起皮质内肾曲管上皮萎缩，肾间质细胞纤维化及肾小球透明样变等也可作用于肝，引起肝脏损伤OTA有三致作用,二、赭曲霉毒素A（OTA）,（四）赭曲霉毒素的产毒条件 产毒微生物寒冷的气候下，
9、产毒霉菌主要是纯绿青霉（P.viridicatum）在温暖的气候下，产毒霉菌主要是赭曲霉（A.ochraceus）产毒的基质 玉米、大米和小麦,二、赭曲霉毒素A（OTA）,二、赭曲霉毒素A（OTA）,产毒的环境条件生长温度范围一般为？，最适生长温度为？最低生长水活度（aw）为？，最适aw为？最适产毒温度一般在？之间随着分生孢子的形成而开始产毒,（五）食品和饲料中赭曲霉毒素的允许残留标准 粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会37次（1991年）会议将人对OTA的周摄入量暂定为112ng/kgbw，47次（1991年）会议将其定为100ng/kgbw我国还没有制定出OTA的卫生标准。,二
10、、赭曲霉毒素A（OTA）,二、赭曲霉毒素A（OTA）,二、赭曲霉毒素A（OTA）,三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol；缩写DON),（一）脱氧雪腐镰刀菌烯醇的结构 DON又称致呕毒素(Vomitoxin)。属单端孢霉烯族化合物，化学结构式如图3-1-3。,图3-1-3脱氧雪腐镰刀菌烯醇化学结构,单端孢霉烯族化合物的化学结构,三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),图3-1-3脱氧雪腐镰刀菌烯醇化学结构,三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),（二）DON的理化性质 一般特性：纯品为白色结晶，熔点为151153(醋酸乙基石油)，分子式为C15H20O6，分子量为296 荧光特点：紫外辐射下
11、不显荧光溶解特性：易溶于水，乙酸乙酯、乙醇、甲醇、氯仿、丙酮等溶剂。不溶于正已烷、丁醇、石油醚,三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),稳定性DON热稳定性较高。按Kamimura等人报道，在食品加工中，烘焙温度210，油煎温度140、或煮沸，只能破坏50。在高压热蒸汽作用下可以使其完全失活据报道,病麦经四年贮藏仍能保留原有毒性,三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),（三）DON的毒性细胞毒性、免疫抑制以及三致作用急性毒性:中毒动物的主要表现为站立不稳、反应迟钝、竖毛、腹泻、食欲下降等；鸭雏的LD50为27.0mg/kg,而小白鼠的LD50为46mg/kg。慢性毒性：呕吐、拒食、皮肤红肿、出血、坏死、结痂等,（四）DON的产毒条件 产毒微生物禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌等产毒的基质 小麦、大麦、玉米、稻谷、蚕豆等，,三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),第二节 真菌毒素检测基本步骤,一、样品的采集和制备二、毒素的提取 三、毒素的净化 四、毒素的分离五、定性和定量,
