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1、附件2光反应性活性氧(ROS)测定试验(征求意见稿)1、范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧(RoS)测定试验的基本要求和方法。本方法适用于评价化妆品用化学原料的潜在光毒性。2、试验目的预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。3、术语和定义下列术语和定义适用于本方法。3.1 光反应性(Photoreactivity)化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。3.2 光毒性(PhototoXiCity)皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。这些光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒
2、性。3.3 辐照度(Irradiance)照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米(Wr)或亳瓦每平方厘米(mWcm2)03.4 光照剂量(Doseflight)照射到某一表面的紫外线或可见光的量=强度X时间(秒),单位为焦耳每平方米(Jm2)或焦耳每平方厘米(cm?)。3.5 活性氧种类(ReactiveOxygenSpecies,ROS)活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。3.6 单线态氧(SingletOxygen,SO)由光辐照化学物质通过11型光化学反应产生的一种自由基。3.7 超氧阴离子(SuperoxideAnionSA)由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一
3、种自由基。4、试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，能诱导发色团激发的某一波长的光子，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧So和超氧阴离子SA）,活性氧是许多光毒性反应中的重要中间物质。单线态氧和咪嗖反应生成的过氧化物中间体对N,N二甲基Y亚硝基苯胺（RNo）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧阴离子与氯化硝基四氮嗖蓝（NBT）反应生成NBT,其在560nm波长下具有光吸收。本试验方法通过分光光度法测定化学物质经紫外线照射后对RNO在440nm下吸光度的减少及对NB在560nm下吸光度的增加来判断该化学物质是否具有光反应性。5、试剂和材料除
4、另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用，并且在使用前应超声处理，以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下：5.1 磷酸二氢钠。5.2 磷酸氢二钠。5.3 N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）。5.4 咪嘎。5.5 氯化硝基四氮映蓝（NBT）。5.6 pH7.4的20mmol/L磷酸钠缓冲液（NaPB）称取593mgNaH2PO42H2O（CAS:13472-35-0）H5.8gNa2HPO4-12H2O（CAS:10039-32-4）,加入约90OmL水，混匀，用1mol/L的HCl将PH值调节为7.4
5、,定容至Io（X）mL后混匀。于2C8C冰箱或室温保存。5.7 0.2mmol/LN,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO,CAS：138-89-6）称取3mgRNO,溶于IoOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.8 0.2mmol/L咪哇（CAS：288-32-4）称取13.6mg咪喋，溶于IOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀，得到20mmol/L咪嗖溶液。用20mmol/L的磷酸钠缓冲液将20mmol/L咪喋溶液稀释100倍，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.9 0.4mmol/L氯化硝基四氮喋蓝（NBT,CAS：298-83-9）称取32.
6、7mgNBT,溶于IOomL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.10 溶剂的选择优先使用分析级二甲基亚碉（DMSO）,对于不溶于DMSo的受试物，可使用20mmol/L的磷酸钠缓冲液作为溶剂。如果受试物在DMSo和磷酸钠缓冲液中不溶或不稳定，也可使用其他溶剂，但应保证受试物在所选溶剂中稳定，且参考化学物质的So值和SA值应在附录A规定的范围内。5.11 待测化学物质溶液的配制待测化学物质的分子量应是已知的。测试终浓度为200molL,如果在200molL浓度下的反应混合物有沉淀、着色或其他干扰等现象，则可以使用20molL为终浓度进行测试。当待测化学物质在20m
7、olL的终浓度下得到阳性结果，表示该物质具有光反应性；但在浓度低于20molL下得到阴性结果，不能表示该物质无光反应性。待测化学物质溶液应现用现配，所有操作均应避免在强紫外线和强可见光照射（例如头顶灯下或在自然光暴露的窗户附近工作），以避免在试验前待测化学物质发生光激活或光降解。待测化学物质在试管中称重，加入5.10项溶剂,涡旋混匀,超声510min,配制成IommoIZL（终浓度200molL）。当终浓度200molL的反应混合物在光照前观察到沉淀、着色或其他干扰等现象时，需将IOmmOI/L的溶液用DMSo稀释成1mmol/L溶液（终浓度20molL）。对于不溶于DMSO的化学物质，使用其
8、他溶剂（如磷酸钠缓冲溶液）时，须使得反应混合物中含有20LDMSO（2%,vv）o5.12 阴性对照及阳性对照以奎宁盐酸盐二水合物（CAS：6119-47-7）作为阳性对照，以二苯甲酮-4（CAS：4065-45-6）作为阴性对照。用DMSO按与受试物相同的方法将阳性对照和阴性对照配制成10mmol/L的储备溶液，分装后于20冰箱冻存，于使用当天解冻，避免反复冻融，1个月内使用完毕。6、仪器和设备6.1 太阳光模拟器6.1.1 选择合适的光源用于提供紫外线和可见光的照射，通过渡光片减少波长小于29Onm的UVe,使光源尽量接近室外日光。推荐的测试条件如下：a）配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线
9、波长29Onm）（见附录B）一辐照度：L8mWcm2至2.2mWc照射1小时（例如，AHaSSlmteStCPS+的指标设置值为250W?）,UVA光照剂量：6.5Jcm2至7.9JZcm2（见附录B）。b）配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长30Onm）（见附录B）-辐照度：3.0mWcm25.0mWcm2,照射1小时（例如，SericSXL-2500V2）,UVA光照剂量：11J/cn?至18Jc?（见附录B）O1.1.2 测试条件根据实际选择合适具体条件。1.1.3 ROS的产生受温度影响,太阳光模拟器应配备温度控制装置,光照期间温度在2029。6.2 反应容器推荐使用石英反应容器（规
10、格见附录C）,避免液体蒸发以及由于塑料盖造成的UV损失。也可使用其他UV透射率大于95%的盖子或密封件替代。实验室使用其他容器时，应使用附录A中的参考化学物质（序号1/7号）确定合适的仪器辐照度及光剂量。6.3 酶标仪。6.4 UVA紫外照度计。6.5 显微镜。6.6 析步骤7.1 将下列成分在避光条件下混合：7.1.1 溶剂为DMSo的受试物：单线态氧SO超氧阴离子SA20mmol/LNaPB480L20mmol/LNaPB855L0.2mmolL咪晚250L0.4mmol/LNBT125L0.2mmol/LRNO250L10或1mmol/L受试物20L10或1mmol/L受试物20L7.1
11、.2溶剂为NaPB的受试物：单线态辆SO超氧阴离子SA20mmolLNaPB460L20mmolLNaPB835L0.2mmol/L咪哇250L0.4mmol/LNBT125L0.2mmol/LRNO250LDMSO20LDMSO20L10或1mmol/L受试物20L10或1mmoI/L受试物20L以20L溶剂替代受试物，作为空白对照。涡旋或超声5-10min后，将200L反应混合物加入到96孔板中，每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。7.2 在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现象，需降低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5s后，使用分光光度计或
12、酶标仪测定光照前So检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。7.3 将96孔板置于石英反应器中，或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件，置于太阳光模拟器中照射Iho记录光照前后的温度。7.4 完成光照后，将96孔板震荡1min,使用分光光度计或酶标仪测定光照后SO检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。试验步骤流程图见附录E。8、分析结果表述8.1 So值和SA值的计算计算受试物及对照品的SO值和SA值，根据三个平行孔的数据计算平均值和标准偏差。1 .根据光照前后So测试孔在440nm下的吸光度计算受试物的So值SO值=440(一)-A4M-(
13、a-b)1000式中：A44(一):光照前44Onm下的吸光度A44o(+):光照后44Onm下的吸光度a：光照前空白对照440nm下的吸光度b：光照后空白对照440nm下的吸光度2 .根据光照前后SA测试孔在560nm下的吸光度计算受试物的SA值SA值=i4s6()56o(一)(b-a)X1000式中：A56o():光照前56Onm下的吸光度A56o(+):光照后56Onm下的吸光度a：光照前空白对照560nm下的吸光度b：光照后空白对照56Onm下的吸光度8.2 试验接受标准试验应满足以下标准：1 .光照前，反应混合物中没有受试物沉淀。2 .光照前后，受试物对反应混合物没有颜色干扰。3 .
14、试验过程中温度控制在20C-29C范围内。4 .所有测试孔A440及A560应在0.02-1.5范围内。5 .应根据历史数据平均值2标准偏差建立实验室内阴性对照与阳性对照的质控范围。以下为根据验证数据得出的95%置信区间：200molL奎宁盐酸盐二水合物200molL二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至-26 .3受试物的光反应性评判标准根据以下标准评判受试物的光反应性:分类样品浓度SOSA25和70具有光反应性200molL7025和70和/或有干扰具有弱光反应性200molL25和20,70具有光反应性20moIL25和20无光反应性200mo
15、lL25和20不确定不属于上述任何一种情况如受试物在200molL和20molL浓度下均有沉淀、着色或其他干扰，则认为该受试物不适用于本方法，受试物的光反应性不确定。附录A参考化学物质检测结果可接受范围表A17种参考化学物质SO值和SA值测定数据的可接受范围。编号化学物名称CAS编号SOSA溶齐IJ浓度1对氨基苯甲酸150-13-0812-11-7DMSO200molL2对氨基苯甲酸乙酯94-09-7-79-7-17DMSO200molL3盐酸多西环素10592-13-9115-429230-468DMSO200molL4红霉素114-07-8-15-11-9-21DMSO200molL5非诺
16、贝特49562-28-977-203-31-11DMSO20molL6L-组氨酸71-00-1-8-128-120NaPB200molL7诺氟沙星70458-96-7131-27157-161DMSO200molL88.甲氧基补骨脂素298-81-731-1370-126DMSO200molL9水杨酸异辛酯118-60-5-5-11820DMSO20molL10口丫咤260-94-6182328121243DMSO200molL11盐酸氯丙嗪69-09-0-56-7066-106DMSO200molL12双氯芬酸钠15307-79-63441647437DMSO200molL13吠曝米54-3
17、1-931225-7-109DMSO200molL14酮基布洛芬22071-15-412034677151DMSO200molL15蔡噬酮酸389-08-254-24688-470DMSO200molL16奥美拉嚏73590-58-6-221-10330216DMSO200molL17盐酸异丙嗪58-33-320768-3-77DMSO200molL附录B300400500600700800太阳光模拟器光谱分布图B为OECD推荐的两种太阳光模拟器的光谱能量分布。XJuC一PZ=BE-IONWavelength(nm)图B太阳光模拟器光谱能量分布86 mm附录C石英反应容器166mm1 2345
18、6789101112AO0000000000OB0100000000000coooooooooooodooooooooooooeoooooooooooofoooooooooooogoooooooooooohoooooooooooo图C石英反应容器推荐规格图示石英盖板推荐厚度为3mm附录D96孔板加样示意图96孔板加样示例如下：123456789101112A单线态氧SO检测孔BBPNTlT2T3T4T5T6T7CBPNTlT2T3T4T5T6T7DBPNTlT2T3T4T5T6T7EBPNTlT2T3T4T5T6T7FBPNTlT2T3T4T5T6T7GBPNTlT2T3T4T5T6T7超氧阴
19、离子SA检测孔注：LB为空白对照；2 .P为阳性对照（奎宁盐酸盐二水合物），N为阴性对照（二苯甲酮-4）；3 .T1-T7为第1至第7种受试物。附录E试验流程图将各反应成分在避光条件下混合混合（涡旋或者超声510分钟）200L混合物加入到96孔板中（每组3个平行）J100倍显微镜下检查溶解情况震荡5s后，检测44Onm和56Onm吸光度光照1小时震荡Imin后，检测440nm和560nm吸光度光反应性活性氧（ROS）测定试验起草说明为加强化妆品的监督管理，进一步提高化妆品使用安全性，中国食品药品检定研究院组织开展了体外ROS（活性氯）光反应性试验方法的起草工作。现就起草工作有关情况说明如下：一
20、、起草原则本方法主要参照OECDTG495“ROS（活性氧）光反应性试验”，参考化妆品安全技术规范为编撰模板编制。本着科学性、先进性和合理性的原则，并兼顾了适用性与可操作性。二、起草过程本标准文本及编制说明起草主要参照OECDTestGuidelineNo.495,根据我国实验室条件进行调整，形成方法草案。本研究由化妆品标准专家委员会立项并通过结题专家论证，形成如下意见及结论：规范文字说明，完善文本，修改后通过。修改后对外征求意见，根据反馈情况对文本进行修改。三、与我国已有相关标准的关系2016年化妆品用化学原料体外3T3中性红摄取光毒性试验方法作为补充方法被纳入我国2015年版化妆品安全技术
21、规范。该方法使用Balbc3T3成纤维细胞进行试验，通过测定3T3成纤维细胞经化学物质和紫外线照射联合作用后细胞吸收中性红的能力或细胞毒性的变化来判断该化学物质是否具有光毒性。尽管体外3T3中性红摄取光毒性检测方法能够正确识别大多数光刺激性化学物质，但对光过敏原组中的化学物质判定准确率有限，因此该方法仍然具有一定局限性。依据ICHSlO,紫外可见光照射后生成的RoS可作为潜在光揖性的标志物，因此ROS（活性氧）光反应性试验可预测化学原料的潜在光毒性，可以作为现有光毒性方法的补充。体外RoS（活性氧）光反应性试验方法未来可以应用在光毒性整合策略中，进一步促进我国化妆品安全性体外替代方法体系的完善
22、。四、与国际同类标准的关系本方法以OECD发布的“ROS（活性氧）光反应性试验”（TG495）为指导原则，根据国内实验条件及操作的具体情况，以现行化妆品安全技术规范为编撰模板，基本操作和OECDTG495基本i致。五、验证过程本实验室开展了内部验证，按照OECDTG495的方法，对复测信度进行验证，结果满意。同时，本项目邀请了4家单位进行了室内及室间的验证，统计复测信度指标，结果满意。各实验室根据OECDTG495对参数要求进行预实验，并根据OECDTG495附录C中参考品及参考品ROS预测结果的可接受范围调整光剂量：当多数参考品结果高于可接受范围时，通过降低辐照度的方式适当降低光剂量；当多数
23、参考品结果低于可接受范围时，通过提高辐照度的方式适当增加光剂量。本单位预实验结果:名称高剂量组(18J)低剂量组(6.5Jm2)中剂量组(9.7Jm2)So值SA值So值SA值So值SA值盐酸氯丙嗪I对氨基苯甲酸TI对氨基苯甲酸乙酯TI盐酸多西环素I红霉素I非诺贝特TIL组氨酸II诺氟沙星I8-甲氧基补骨脂素水杨酸异辛酯TI口丫咤I双氯芬酸钠II吠喔米I酮基布洛芬II蔡嚏酮酸奥美拉嗖I盐酸异丙嗪II:表示结果高于OECDTG495附录C中可接受范围;!：表示结果低于OECDTG495附录C中可接受范围；:表示结果符合OECDTG495附录C中可接受范围。六、实验室验证结果经5家单位以44种盲样化合物对本方法进行实验室间验证。其中4家单位进行了室内复测信度分析，各单位室内数据ICC系数分别为0.986、0.914、0.991和0.959,复测信度良好；各单位间数据ICC系数为为0.839,室间一致性良好。本方法可用于评价化妆品用化学原料的光反应性。
