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1、ICS65.020.30CCSB4111B37山东省地方标准DB37TXXXX-XXXX猪疫病诊断技术第1部分：圆环病毒Diagnosistechnologyofswineepidemicdisease-Part1:CircovirusXXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施山东省市场监督管理局发布本文件按照GB/TL1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB37/T*猪疫病诊断技术的第1部分。DB37/T*|已经发布了以下部分：第1部分：圆环病毒。本文件代替DB37/T18272011猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术，与DB37/T18
2、272011相比,除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a）增加了“引言”（见引言）；b）更改了提出与组织实施单位（见前言，2011年版的前言）；c）删除了主要起草人和起草单位（见2011年版的前言）；d）更改了“范围”（见第1章，2011年版的第1章）e）增加了“规范性引用文件”和“术语和定义”（见第2章和第3章）；f）更改了“试剂或材料”和“仪器设备”相关内容（见第4章和第5章，2011年版的第2章）；g）增加了“临床诊断”和“病理诊断”（见6.1、6.2）；h）更改了“实验室诊断”（见6.3,2011年版的第3章）；i）增加了“参考文献”（见参考文献）。请注意本文件的某些内容可能涉
3、及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件的历次版本发布情况为：2011年首次发布为DB37/T18272011；本次为第一次修订。疫病是威胁养猪业健康发展的主要原因,疫病的精准诊断是综合防控的前提。猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒（PCV）引起的一种多系统性疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）.猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）和繁殖障碍性疾病等，主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱，同时可以导致免疫抑制，进而导致继发或混合
4、感染是国际公认的严重危害养猪业发展的疾病之一，对生猪生产造成巨大的经济损失。为规范我省猪圆环病毒诊断工作，以进一步提高猪疫病综合防控工作能力，保护养殖业公共卫生安全，最大限度减少猪圆环病毒病造成的经济损失，本文件结合先进经验和行业的实际，严格按照GB/T1.1标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的要求编写，以“科学性、先进性、系统性、适用性”为原则，聚焦猪圆环病毒病诊断的关键参数，制定猪疫病诊断技术第1部分：圆环病毒。猪疫病诊断技术第1部分：圆环病毒1范围本文件描述了猪圆环病毒1型(PorcineCircovirusTypeLPCVI本2型(PorcineCircovirusType1,P
5、CV2)和3型(PorcineCircovirusType3,PCV3；)的荧光PCR检测及鉴别检测技术。本文件适用于猪圆环病毒1型、2型和3型的快速分子诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂或材料A1水：符合GB/T6682中规定的一级水。41磷酸盐
6、缓冲溶液(PBS)：取磷酸二氢钾(KH2POl)0.27g、磷酸氢二钠(Na2HPOt)1.42g、氯化钠(NaCl)8g,氯化钾(KCI)0.2g,加灭菌水约80OmL充分搅拌溶解，加入浓盐酸调PH至7.4,定容至1000mLo4 1核酸提取试剂：市售病毒DNA/RNA提取试剂盒或磁珠法提取试剂盒。A4荧光PCR试剂盒。5仪器设备5 1荧光定量PCR仪。K3震荡研磨仪。耳1高速冷冻离心机：离心力28000g。KA电子天平：精度0.0001go三iA生物安全柜。S6冰箱：28,-20C以下和-70C以下。弓7涡旋振荡器。A1临床诊断6 .1.1流行特点猪是PCv的天然宿主，各种年龄、不同性别的
7、猪都可以感染，但以哺乳期和育成期的猪最易感。病猪和带毒猪是主要的传染源，可经口腔、呼吸道、精液感染不同日龄的猪，少数孕猪还可经胎盘垂直传播。6.1.2临床症状6.1,2.1断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)引起断奶期进行性消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、厌食、精神沉郁、被毛粗乱、出现以咳嗽、喷嚏、呼吸加快及呼吸困难为特征的呼吸障碍，10%20%猪的皮肤和可视粘膜可见黄疸,猪群的死亡率增加，体表淋巴结，特别是腹股沟浅淋巴结肿大，有的还表现腹泻和中枢神经症状。其它临床症状，包括咳嗽、发热、胃炎、脑膜炎及突然死亡。6.1.2.2猪肾病与皮炎综合征(PDNS)断奶仔猪和育肥猪食欲减退，有时体温上升，皮下水
8、肿，皮肤表面出现圆形或不规则形隆起，红色或紫色、中央发黑的斑块。破损皮肤常融合成大的块。通常病变在后肢、腹部首先发现，然后慢慢向胸、耳等部位扩展。剖检，在大部分死亡猪中，可见双肾肿大、苍白、皮质有出血小点。6.1.2.3仔猪的先天性震颤(CT)出生后3周龄仔猪，因痉挛而出现步态异常姿势，从双耳，被毛和尾巴等发抖，发展到全身肌肉有节奏性扭摆，后肢严重痉挛，呈跳跃运动等。欲称“仔猪跳跳病”或“仔猪抖抖病”，是仔猪刚出生不久，出现全身或局部肌肉阵发性挛缩的一种疾病。另一种表现是后肢肌肉呈强直性痉挛，后肢分开，似犬坐姿势，尾部轻微震颤，病猪可在3周内康复。6.1.2.4猪增生性和坏死性肺炎(PNP)与
9、保育猪和育肥猪发生的呼吸道病有关。PNP的确诊主要依据组织病理学变化，表现为增生性和坏死性肺炎，病猪主要表现呼吸困难，肺脏见点状出血。69病理诊断剖检病变为猪只消瘦，贫血，皮肤苍白，黄疸，最显著的剖检变化是全身淋巴结肿大，特别是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大25倍，有时可达10倍。切面硬度增大，可见均匀的白色，所有病例几乎都能看到肺萎缩不全，重量和硬度增加，部分病例尖叶有固质化、致密的病灶，肺有轻度的多灶性或高度的弥漫性间质肺炎。肺脏肿胀，坚硬似橡皮样；肝脏发喑，肝小叶间结缔组织增生。肝脏最常见到门脉周围淋巴细胞、组织细胞浸润，具有窦状隙内单核炎性细胞集聚和肝细
10、胞的单细胞坏死为特征的肝炎。慢性死亡病例，由于黄疸而使肝小叶周围纤维化，肝细胞坏死、消失及单核细胞弥漫性浸润。肾脏水肿、苍白，被膜下有坏死灶。显微镜观察，淋巴结的皮质区及副皮质区显著扩张，有单核和巨噬细胞浸润，有时散布有大量的多核巨细胞，有些淋巴细胞萎缩，少数情况还有坏死。肝脏表现不同程度的炎症，有淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞浸润；肾脏的皮质和髓质也有炎症存在。61实验室诊断6.3.1样品采集6.3.1.1细胞培养样品按照GB19489规定，取细胞培养样品。6.3.1.2剖检样品按照NY/T541规定采集病死猪的淋巴结、脾脏、肾脏和肺脏等组织样品。6.3.2样品的保存及运输样品2C8C贮藏
11、。样品保存在2C8C条件下不超过24h,-20以不超过3个月，-70C以下不超过5年。必须低温保存运输样品，且在规定温度下的保存期内送达和检测。6.3.3样品处理6.3.3.1淋巴结、脾脏、肾脏和肺脏等组织样品取适量大小的组织块放入盛有500IlLPBS（4.2）的研磨管中，6000r/min震荡研磨45s,制成约10%的组织匀浆液,5000rminK5min,上清液备用。6.3.3.2细胞培养样品将细胞培养样品反复冻融3次，3000”1115离心5111H，弃去细胞碎片，上清备用。6.3.4试验步骤6.3.4.1核酸提取采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核
12、酸置于冰上保存，否则应置于-20冰箱保存，具体操作步骤如下：a）取上清液（6.3.3）200HL置于1.5mL离心管中，加入500HL裂解液，在泯旋振荡器上振荡30s混匀，室温静置2min；b）裂解后的液体移入吸附管柱，6000rmin,离心5min；注：此时病毒DNA会吸附再管柱底部的膜上。c）加500HL洗液至管柱上，600017111壮，离心5|11山，弃去洗液；d）重复上一步骤1次；C）8000r/min离心IOnlir1,去除残留在膜上的乙醇；f）将吸附柱转移至新的离心管中，开盖室温静置2min；加入50L洗脱液，室温静置Imin；g）将含有吸附柱的离心管,8000r/min离心L5
13、min,得到DNAo6. 3.4.2荧光PCR扩增设25IlL反应体系，荧光PCR扩增反应液体系见表1,荧光PCR扩增引物参见附录A。表1荧光PCR扩增反应液体系厅号组分用寸12XSYBRGreenProTaqHSPremix*612.5210MPCV-F1.0310MPCVl-R1.04IoJMPCV2-R1.0表1荧光PCR扩增反应液体系（续）序号组分用量510MPCV3-R1.06模板DNA1.57dd076.3.4.3检测设置阳性、阴性对照，荧光定量PCR扩增反应条件见表2。表2荧光定量PCR扩增反应条件序号进程反应条件反应时间1预变性9530s2变性95eC30s3退火6230s4延
14、伸72,CIOs5循环数（2-4）406信号采集退火时采集一6.3.5结果判定6.3.5.1结果分析条件设定直接读取检测样品的熔解曲线峰值温度，温度误差0.1C范围内。6.3.5.2质控标准6.3.5.2.1阳性对照参见附录Bo6.3.5.2.2阴性对照熔解曲线无峰值。6.3.5.3样品检测结果分析在阳性和阴性成立前提下，样品检测结果判定如下：a）熔解曲线峰值温度为84C,则样品中含有PCv1；b）熔解曲线峰值温度为85C,则样品中含有PCV2；c）熔解曲线峰值温度为82C,则样品中含有PCV3；d）熔解曲线峰值温度为84C和85,则样品中含有PCVI和PCV2；e）熔解曲线峰值温度为84C和
15、82,则样品中含有PCVl和PCV3；f）熔解曲线峰值温度为85C和82,则样品中含有PCV2和PCV3；g）熔解曲线峰值温度为84、85、82C,则样品中含有PCV1、PCV2和PCV3。附录A（规范性）荧光PCR扩增引物荧光定量PCR扩增引物见表A.1。表A.1荧光定量PCR扩增引物引物名称序列PCV-F5,-Tkgatgatyttttatggstgg-3,PCVl-R5-Gtcagcagttgaggactaccatt-S,PCV2-R5-AGTATCCGCCGTGGC-3,PCV3-R5-CTCCTCGGCCTCCCT-3,注：简并碱基K：G/T；Y：C/T；S：G/C附录B（资料性）阳性对照阳性对照样品PCv1、PCV2、PCV3的熔解曲线峰值温度分别约为84C、85C、82,阴性对照样品没有熔解曲线时试验成立（见图B.1）。1PCV3(82C):2PCVl(84C):3PCV2(85C)o图B.1阳性对照参考文献1中华人民共和国农业农村部病死及病害动物无害化处理技术规范
