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1、神经培养技术,山东大学医学院解剖学教研室,简 介,体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）细胞培养（cell culture）器官培养（organ culture）就是将活体结构成分（如活体组织、细胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。,萌芽：1885年德国学者Roux将鸡胚的神经板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内存活数天。起步：1907年，Harrison首次成功地用蛙淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程。,神经培养的发展历史,发展：在设备、条件和方法上不断改进，
2、尤其是自二战结束后，进入了新的飞速发展的阶段。,人类神经系统被公认为是自然界最复杂的系统。神经科学（neuroscience）已成为当今人类医学和生命科学的前沿。多个学科、多个研究领域所进行的研究，均能以神经培养作为研究手段之一。,神经培养与神经科学,一、按培养物的整体性及大小分类,细胞分散培养（dissociated culture）器官-组织型培养（器官型培养）（organotypical culture）,神经培养的分类,可直接按培养的对象命名：如小脑培养，神经节培养，星形胶质细胞培养，少突胶质细胞培养，雪旺细胞培养等。,二、按培养的对象分类,静置培养：载片式、试管式、培养瓶式等。旋转管
3、培养：不断缓慢转动，以便经常更动培养液与培养物的关系。,三、按培养的方式分类,原代培养（primary culture）：神经细胞一般不再分裂，不传代，故属原代培养。再培养（sub-culture）：把培养物切、割、取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。联合培养（coculture）：把两种或两种以上的组织放在一起进行培养。,四、其它,按开创研究者的名字命名，如Maximow双盖片法。在培养液中专门加入某种激素、神经生长因子或某些药物而标以某某特殊培养。五、以上方式的综合或特殊设计的培养 综合上述数种方式的培养或培养与移植相结合的特殊设计的培养等。,一、无污染环境 二、温度 37 三、气体环境
4、和氢离子浓度 95%空气和5%二氧化碳 pH值为7.27.4,神经培养所需的环境条件,葡萄糖：较高。氨基酸维生素促生长因子 神经生长因子（NGF）其它,四、基本营养物质,五、渗透压,260320 mOsm/kg,半固体培养基液体培养基 天然培养基（natural medium）合成培养基（synthetic medium）无血清培养基（serum free medium）,六、培养基,玻璃多聚赖氨酸覆着底物 一次性塑料细胞外基质成分细胞粘附分子单层非神经元细胞,七、培养器皿和附着底物,神经培养的基本实验设备,一般包括：准备室 无菌操作室 缓冲间 进行其它操作的实验间,一、神经培养室的建立,二、
5、实验室设备,超净工作台（super clean bench，hood）、CO2培养箱、电热干燥箱、高压蒸气消毒器、冰箱、倒置相差显微镜、解剖体视显微镜、自动纯水蒸馏器、洗刷装置、抽滤装置、离心机、微波炉等,三、器械四、培养器皿,1.玻璃器皿 2.塑料器皿,培养用液,平衡盐溶液（Balanced Salt Solution,BSS）天然培养基（Natural Medium）合成培养基（Synthetic Medium）其它,一、水和平衡盐溶液,1.水：是细胞赖以生存的主要环境。2.平衡盐溶液：是从Ringer生理盐水发展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。PBS、Hanks、D-Hanks、Tyr
6、ode、Dulbecco、Earle、Eagle,几种常用平衡盐溶液的组成成分（g/L）,1.血清 牛血清 成年牛血清 新生牛血清 胎牛血清 马血清 羊血清,二、天然培养基,2.胚胎浸出液：鸡胚浸出液、牛胚浸出液 内含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，有促进细胞生长的作用。,液体培养基、粉制培养基BEM：Basal Eagle Medium 基础Eagle培养基MEM：Minimum Eagle Medium 低限量 Eagle培养基DMEM：Dulbeccos Modified Eagle Medium Dulbecco改良Eagle培养基IMEM：Iscove Modified E
7、agle Medium Iscove改良Eagle培养基,三、合成培养基,四、无血清培养基,以合成培养基配成基础培养液，再补加其它成分。1.基础培养液 Ham F12和DMEM混合培养液 DMEM/F12(1:1)神经元基础培养基（neurobasal medium）,2.生长附加成分比较通用的：胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺（丁二胺）B-27、N-2（Gibco）,全培液,以下各种成分各10 ml配制成全配液40 ml（葡萄糖含量为6g/L）：胎牛血清DMEM九天鸡胚渗出液Glucose/BSS（5%葡萄糖溶液 4.7 ml，Tyrodes BSS 5.3 ml）,其它常用溶液,1.消
8、化液 胰蛋白酶溶液（trypsin solution）适于消化细胞间质（主要是纤维）较少的软组织。需用不含Ca2+和Mg2+的平衡盐溶液配制。用血清或含血清的培养液以终止消化作用。0.25%、0.125%、0.08%,胶原酶溶液（collagenase solution）对胶原有强的消化作用，适于消化成年的背根神经节等纤维较多的组织。此酶作用缓和，且无须机械震荡。Ca2+、Mg2+和血清存在下仍有活性。,EDTA溶液 EDTA（二乙胺四乙酸二钠）是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离解作用，毒性小，价格低廉，使用方便。,2.pH调整液NaHCO3液 7.4%、5.6%、3.7%HEPES液（羟乙基
9、哌嗪乙硫磺酸）终浓度1050 mmol/L,3.抗生素液青霉素 100U/ml链霉素 100g/ml4.谷氨酰胺溶液 常配成100倍（200 mmol/L）终浓度14 mmol/L,5.有丝分裂抑制剂阿糖胞苷（ara-c）35 g/ml5-氟脱氧尿嘧啶,神经培养的基本技术程序,培养前准备新鲜组织取材培养接种标本维持观察记录,培养前准备,1.实验室准备 2.器皿准备 3.液体准备 4.动物准备,取材,新鲜、无菌 动作轻柔，切忌损伤组织 熟练，操作时间过长会增加污染机会 取材时要滴加平衡盐溶液以防干燥培养接种 包括组织块接种和单细胞悬液接种。,器官-组织型培养 组织不能太大，通常以薄片形式，厚度一
10、般不超过1 mm。,细胞分散培养 细胞分散培养是从20世纪50年代才逐渐开展起来的。神经细胞分散培养则开始于1952年由Moscona进行的鸡视网膜细胞的分离培养。,神经组织的分离 分散细胞的目的在于使细胞之间的连接解离，制成单细胞悬液。常用的分散细胞的方法有：机械分散法和消化分离法。,标本维持,37 5%CO2 培养箱 更换培养液 一般23天,观察记录,肉眼或放大镜下观察倒置相差显微镜观察电子显微镜观察,新生大鼠基底神经节神经元的分散培养,取新生1天大鼠1只，75酒精棉球消毒后取心脏处死。剪除头颅处皮肤，充分暴露颅顶骨。于颅顶骨基底环状剪开，小心去除，切勿损伤脑组织。从后内侧向前外侧用眼科镊
11、小心翻去大脑皮层，暴露基底神经节。小心夹取基底神经节组织，放入有1 ml D-Hanks液的小烧杯内，眼科剪剪成1 mm3组织块。,把组织块移到离心管内，吸除多余的D-Hanks液后用0.125胰酶1 ml 37消化30 min。时间不定50l胎牛血清终止消化，滴管小心吹打，打散组织。200目铜网过滤，离心1000 r/min5min。弃上清，用含10胎牛血清DMEM/F12培养液重悬悬沉积物，计数板计数，调整细胞密度为5105/ml。,六孔培养板每孔2 ml培养液，置于37饱和湿度含5CO2空气的培养箱内培养。24 h后全量换液，以后每隔2天全量换液。若杂质较多可在 培养第3天加入终浓度为5g/ml的阿糖胞苷作用24 h后换液。,
