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1、实用组织学与细胞化学 研究技术 组 织 学 技 术,一 组织学技术的发展与应用 内 容：组织学制片技术、胚胎学制片技术、组织化学技术、荧光技术、免疫组化技术、组织培养技术、组织工程技术等。光学显微镜技术：特殊显微镜技术（荧光、倒置、相差）、显微摄影技术等电子显微镜技术：电镜技术、电镜细胞化学技术等应 用：Hooke发现细胞，1811年改良了显微镜组织学基础。但是，不能看到透明的切片标本。1851年，发现卡红可染细胞核，1865年，苏木精能染细胞核。十九世纪20年代Feulgen创立核酸反应。30年代，相继发明了相差显微镜。特别是，50年代组织化学与电镜技术迅速发展和提高，组织学技术进入了新时期
2、。,二 组织切片方法分类1切片法：石蜡切片、明胶切片、火棉胶切片、电镜超薄切片等（微米）2涂片法：血液等液体3磨片法：骨等坚硬组织4分离制片法：分离单个细胞平滑肌细胞、肝细胞等5印片法：肝、脾、淋巴结等6活体制片：注射胎盘兰等，观察巨噬细胞的活动7超活体染色制片：活体观察精子形态与活动等8整体切片法：用大型切片机，人胚、肝、肾、脑等,组织制片技术 普通制片技术HE切片术 一 基本程序(一).动物取材 必须根据科研或教学的目的与要求确定，医学领域以人的材料为最好，高级动物猴、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠等。动物麻醉法：1乙醚吸入麻醉：小鼠、大鼠、豚鼠等。在玻璃缸内进行。2注射麻醉法：苯巴比妥、乌拉坦
3、等，猴、猫、狗、兔等大型动物，静脉或腹腔注射。3 直接杀死法：小鼠、大鼠、豚鼠等，用金属器械猛击后脑部第四脑室区。,取材顺序：1 腹腔器官：肝、胆、胃、肾上腺、胰、脾、十二指肠、空肠、回肠、结肠等2胸腔器官：心脏、肺3盆腔器官：膀胱、卵巢、输卵管、子宫等4神经系统：大脑、小脑、脊髓等5眼球、内耳,（二）固定 目 的：保持组织内细胞的形态、结构及其化学组成，使与生活时原有形态、结构及化学组成相似。1蛋白质、脂肪、类脂体、酶等沉淀或凝固抑制自溶。2组织内各种不同物质产生不同的折光率，便于显微镜下观察。3某些固定剂可起到硬化作用，有利于组织切片：甲醛、乙醇、氯仿等。4某些固定剂可起到媒染作用：重铬酸
4、等。固定具体方法：1小块固定法 11 0.3cm（不超过0.5cm厚）。2整体固定法（小动物灌流法），效果好。固定液能迅速渗透到各器官、组织。具有一定硬度，有利于薄切。可避免因取材时间过久保持新鲜状态。3蒸汽固定法 用于涂片、印片等（骨髓涂片、淋巴印片）。,固定液：应具有以下性能 1.对蛋白质、脂肪、类脂体、碳水化合物等具有沉淀、凝固作用。2.具有一定穿透力迅速进入组织。3.对组织不引起收缩或膨胀。4.对组织产生一定的硬化作用。5.具有一定pH值。6.对染色无副作用。,常用固定剂：1.单纯固定剂：甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸甲、锇酸等。甲醛：常用，pH值为中性。穿透组织速度快，固定均匀，组织收缩小
5、。它是蛋白质最好的固定剂，在组织化学中广泛应用。乙醇：常用的固定剂与保存剂，穿透组织速度快。具有固定、凝固蛋白质作用，亦具有硬化组织和脱水等作用。丙酮：可作固定剂与脱水剂，对某些酶（碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等）固定效果好。锇酸：强氧化剂，不能与甲醛、乙醇等混合。使蛋白胶状固定而不发生沉淀，为脂肪、类质脂、髓鞘等优良固定剂。目前为电镜标本常用的固定剂。2.混合固定剂：甲醛混合固定剂、乙醇混合固定剂、丙酮混合固定剂、重铬酸甲混合固定剂、锇酸混合固定剂等。,（三）冲洗目 的：1停止固定液继续对组织的作用。2除去组织中多余的固定剂，以免影响染色。方 法：1.简易流水冲洗法。2 系列玻璃瓶或水槽冲洗法。,
6、(四）脱水目 的：1.除去组织中含有的水分脱水。2.脱水后便于石蜡包埋等。脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等。方 法：由低浓度逐渐升高浓度，以避免组织收缩。23mm 5mm50%Alc 68h 612h70%68h 612h（过夜）,80%46h 68h95%（）24h 36h95%（）24h 36h100%（）12h 24h100%（）12h 24h,（五）组织透明 乙醇不能与石蜡混合，需要经过一种乙醇与石蜡之间媒浸物，即透明剂。透明剂可能取代乙醇而使组织呈透明状，而液态石蜡则可取代透明剂乙醇进入组织。当液态石蜡形成固态之后，便于薄切。常用透明剂：二甲苯 易挥发，折光率1。497，沸点144，透明
7、力强。此外，甲苯、苯、氯仿、丁香油等。步 骤：1先二甲苯：纯乙醇（1：1）2二甲苯,（六）包埋1渗蜡（浸蜡）：重要步骤。熔化为液态的石蜡透过组织间隙进入到组织中。步骤：（1）软蜡：熔点54560C 透蜡（2）硬蜡：熔点56580C 渗蜡 以上均在温箱中进行。不能超过600C，否则变脆、收缩。2.包埋：硬蜡 60620C,（七）切片切片机：回转切片机、滑动切片机、冷冻切片机等切片是整个制片过程中关键的步骤（切片厚度：46m）（八）切片贴展 将薄切的切片贴附载玻片上要 求：1牢固，染色时不能脱落。2展开皱褶，不影响将来的观察。,（九）染 色染 料：根据染料的来源分为天然染与人工染料两种。染色化学性
8、质分为弱酸性、强酸性、弱碱性、强碱性及中性。依染色对象分为胞核染料与胞质染料。1染料的来源天然染料：为天然产物，从动物或植物体中提取的苏木精 从苏木树的树心中提炼出来的为优质的细胞核染料。胭脂红（卡红）雌性介壳虫（胭脂虫）中加工而得染色质着色最佳。地衣红（俄西印）地衣纲质物（茶荠地衣）中提取弹性纤维染料。,人工合成染料：由芳香环或具有芳香环性质的杂环化合物所构成。硝基类（苦味酸）：胞浆染料醌型苯环类：甲基绿、甲基紫、酸性复红、水溶性苯胺兰、孔雀绿、亮绿等。丫叮染料：伊红丫、丫叮黄等。醌亚胺类染料：美兰、甲苯胺兰、硫堇、中性红等。偶氮类染料：偶氮卡红、桔黄G、苏丹、刚果红、胎盘兰等。（十）封片H
9、E染色的步骤与方法 染色步骤:1.切片脱蜡 二甲苯 510分钟 2.切片从而甲苯中取出,无水乙醇中13分钟,洗去石蜡和二甲苯 3.切片浸入95%乙醇中13分钟,组织切片呈白色 4.切片浸入80%乙醇中12分钟,逐步降低乙醇浓度 5.切片经lugol氏碘乙醇35分钟,除去组织中的汞盐沉淀 6.普通水冲洗碘液 7.金如5%硫代硫酸钠12分钟,洗去棕色 8.普通水-蒸馏水漂洗,以备染色 9.切片入苏木精染色,1015分钟 10.水洗,11.切片经盐酸-酒精分色1020秒.此为苏木精染色个关键-细胞核染成深蓝色 12.充分水洗(注意:不要洗掉切片!)13.0.51%伊红染胞质310分钟,淡红色即可 1
10、4.95%乙醇中分色13分钟,洗去切片上多余的伊红 15.95%乙醇中继续分色13分钟 16.100%乙醇中脱水鉴别23分钟 17.100%乙醇中完全脱水23分钟 18.立即二甲苯中透明35分钟 19.中性树胶封片 20.镜检染色结果:细胞核-深蓝色,细胞质-红色,结缔组织为淡红色,肌纤维为红色,胶原纤维为红色,软骨组织为深蓝色,红细胞为桔红色 涂片:血液等 铺片:疏松结缔组织、肠系膜等 磨片：骨、牙等 人工假象：凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、褶、色素沉着等。几种特殊显微镜：1相差显微镜 观察组织活细胞，标本不染色，反差小。2倒置显微镜 目镜在下，光源在上，观察瓶底培养的活细胞。,人工假象,小 结:1。简述HE切片制备的大体程序？2。组织切片有几种方法？3。简述组织取材的大体顺序？,谢 谢！,
