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1、组织芯片技术,组织芯片是由生物芯片发展延伸而来的一种特殊的生物芯片技术,是生物芯片重要的组成部分。,生物芯片(biochip)是将大量特定核酸片段、多肽分子、细胞等按照一定的设计方案,通过微加工及微电子技术固定在载体(如硅片、玻片、尼龙膜等)的表面形成生物分子点阵。生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和组织芯片。,组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray)技术,是由Kononen 等于1998 年首先建立并报道,一般是将数十至上百个甚至更多小的组织整齐有序地排列在一张载玻片上而制成缩微组织芯片,即组织切片。,组织芯片技术是以形态学为基础的分子生物学新技术,
2、可以做常规病理学的HE 染色、各种免疫组织化学染色、组织化学染色、原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR和原位RTPCR 等,可在同一张切片上高通量获得组织学、基因和蛋白的表达信息,这项技术的应用范围涵括了整个生命科学中各个基础研究、临床研究、应用研究以及药物开发的相关领域,选取所需蜡块,常规切片做HE 染色,显微镜下 确定目标区并做定位标记。,1 组织芯片制备过程,采用组织芯片仪在受体蜡块上打孔,并精确排成 微孔阵列。在做标记的蜡块上钻取组织柱,按设计方案移到 受体蜡块上。,把设计好的蜡块放入温箱,根据蜡质,调定温箱 温度,在半融状态下取出,室温冷却,放入4 冰 箱中备用。借助特定切片辅助系统粘
3、着包被带卷片系统,对组织芯片蜡块连续切片。切片厚度2 3m,一般可切片50100 张。,全自动组织芯片仪,1.采用软件自动控制，按照实验者的设计方便、快速和精确地创建高密度或低密度的组织芯片。,2.界面友好便于操作：能显示保存一些重要参数；提示用户需要 取样的样品块代号及组织类型；配有摄像头，原始腊块的图像直接反映到屏幕上，取样时可在屏幕上用鼠标点取定位。,3.可以进行精确的3维自动精确控制，坐标打孔位置，打孔深度，,4.可以同时制做多个相同设计组织芯片受体蜡块。,常见的分类方法:,2.组织芯片分类,根据一张芯片上样本含量的多少分为 低密度芯片(600 点),目前国际上常用的TMA的标本量多为
4、60-100个，组织片的直径在2mm左右。一般情况下，在直径2mm的组织片上有约100000个细胞，而直径0.6mm的组织片上仅有约30000个细胞。,按组织来源分为,人类组织芯片,疾病组织芯片,正常组织芯片,胚胎组织芯片,恶性肿瘤组织芯片,良性肿瘤组织芯片,其它疾病组织芯片,动物组织芯片,预后组织芯片 由治疗前后的肿瘤组织组成，用 于寻找与治疗和预后有关的标志物。,肿瘤组织芯片,多肿瘤组织芯片（由多种类型肿瘤组成，用于肿瘤 基因和/或相关基因的筛选）,肿瘤进展组织芯片（由不同发展阶段的肿瘤组织组 成包括癌前病变、甚至正常组织）,应用组织芯片技术研究的肿瘤范围很广,几乎涉及全身,包括胃癌、乳腺
5、癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、大肠癌、卵巢癌等,3.组织芯片的应用,（1）组织芯片在肿瘤学研究中的作用,不同组织来源肿瘤的相关基因表达状况,有学者采用组织芯片技术,选用5 种常用抗体(AE1/3、波形蛋白、CD45、结蛋白和S-100 蛋白)对54 例正常组织和60 例肿瘤标本进行了抗原检测,结果证实了大部分正常组织与肿瘤组织之间可表达相同的抗原,部分抗原具有特殊性。,同一肿瘤不同发展阶段的相关基因表达状况,用前列腺不同阶段的病变组织（良性前列腺增生、原发癌、转移癌及激素治疗失败后的局部复发癌）制成组织芯片。检测5 个基因（男性激素受体基因、myc、erbB-2、细胞周期蛋D
6、1、N myc）。证明前列腺组织不同阶段的病变具有一些相关的基因类型,转移癌与myc 基因扩增有关，激素治疗失败后的局部复发和转移癌与男性激素受体基因扩增有关。,利用组织芯片技术和免疫组织化学技术(SP法)检测40例原发性肝细胞肝癌(HCC)及其相应癌旁、远离癌正常组织中Rb蛋白的表达情况,证明HCC的发生、发展与Rb蛋白的缺失可能有关。,组织芯片与基因芯片联合应用,发现新 的肿瘤相关基因,揭示未知的生物功能,对激素治疗失败的前列腺癌的病因学进行cDNA芯片表达谱研究，并对高表达基因作组织芯片验证，筛选到在前列腺癌激素治疗失败的样本中显著表达的胰岛素样生长因子结合蛋白2，提示胰岛素样生长因子可
7、能是前列腺癌发展过程中关键的信号调节途径。,（2）组织芯片在免疫组织化学质量控制中的应用,可根据质控的需要设计出各种不同组织芯片,同时对多种不同情况进行检测,如抗体染色是否成功,染色的强弱情况,有没有内源性生物素的干扰等。,北京友谊医院病理科制备标准化组织芯片进行免疫组化质控测定 每张测试片中含9 个组织芯,而每个点都代表不同的组织,阴性和不同程度的阳性都包含在内,能充分反映染色质量的优劣。并且选用了含生物素高的肝和肾作为标记点,同时又可检测使用生物素标记检测系统的实验室在免疫组化染色前是否灭活内源性生物素。,左：弥漫性大B细胞淋巴瘤CD20染色（染色理想）右：弥漫性大B细胞淋巴瘤CD20染色
8、（染色太浅）,左：PR染色，由于未封闭内源性生物素而导致肝细胞胞质着色右：PR染色，由于未封闭内源性生物素而导致肾细胞胞质着色,左：乳腺癌PR染色（染色理想）右：乳腺癌PR染色（染色不理想）,利用组织芯片技术制作特殊染色阳性对照的组织芯片,将阳性对照的组织芯片与待检测的组织裱在同一张玻璃切片上,进行特殊染色,（3）组织芯片技术在特殊染色阳性对照中的应用,4.组织芯片的优点,（1）高通量,利用组织芯片技术和免疫组化技术检测120例胃粘膜病组织中13种细胞周期调控因子(Ubipuitin、p16、p21、p27、p53、p57、cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE、CD
9、K2、CDK4、CDK6)的表达,仅用13张芯片就完成了全部实验,并获得了胃粘膜疾病中13种细胞周期调控因子表达的数据。,（2）平行性,肿瘤组织芯片技术采用同一标准选材、操作和判定结果,所得结果均一可靠,（3）实验误差小 组织芯片可同时检测一种肿瘤不同阶段的基因表达状况,能在一张切片上同时看到一个肿瘤组织在原位、转移、复发中的基因扩增情况。它使分析成百乃至上千个肿瘤标本中DNA、mRNA、蛋白质的工作在最短的时间内完成。组织芯片中的众多组织都处在相同条件下进行实验,因此较传统的病理切片的实验误差小。,（4）高效性 组织芯片因其体积小,信息含量高 省时、省力、节约经费、节省试剂（12 周之内可完
10、成数千个组织标本的数十个基因表达或蛋白分子的定位、定量、定性分析。是传统病理学方法所需费用的1/101/100）可最大限度地利用有限的标本资源,易于开展交流及合作,(5)用途广泛 既可用于基础研究,也可用于临床研究。可用于分子诊断,预后指标筛选、治疗靶点定位、抗体和药物筛选、基因和蛋白表达分析等等,5.局限性,（1）组织标本的标准化问题 档案蜡块组织的前期固定和处理不规范，处理方法不统一，尤其是对某些特殊标本的处理不够准确，使其存在一定程度的蜕变，往往会出现假阴性结果。这些在对组织芯片进行分析时就不能采用同一标准去评价和分析，不利于实验结果的综合评定,更不利于实验科室间的信息交流与合作。,（2
11、）芯片中组织标本的代表性 组织芯片虽然可制成高密度点阵，但其精确性并不与点阵数目呈完全正相关，主要问题是取样点小，在构建肿瘤组织微阵列时所取样本是否正确，并且由于肿瘤细胞存在异质性问题，所取位点不能完全代表肿瘤的全貌。但根据对乳腺癌预后相关标记物（ER、PR 和HER2）的对比分析表明，从组织块获取一个点与常规组织切片的符合率超过90.0%，而2 个点即可达到95.0%以上的精确性。多点取材，组织芯不能太小。,(3)组织芯片制备 组织芯片在制备过程中存在的问题：石蜡包埋组织芯片不能同时检测DNA、mRNA 和蛋白质的改变,因为三者最佳的固定条件不一致。冰冻切片上进行点阵设计困难。存在一些无效组织、组织芯片的移位或脱落、假阳性或假阴性反应等问题。,
