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1、细胞周期调控,生物工程学院王丹,MPF的发现及其作用:,MPF,即卵细胞促成熟因子(maturation-promoting factor),或细胞促分裂因子(mitosis-promoting factor),或M期促进因子(M phase-promoting factor).背景一:Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞在灭活仙台病毒介导下诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的染色体凝集,称之为染色体超前凝集(prematurely condensed chromosome，PCC)。如图所示:,G1期PCC为
2、单线状，S期PCC为粉末状，G2期PCC为双线染色体，因DNA未复制;因DNA由多个部位开始复制;说明DNA复制已完成。,人M期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，称为细胞促分裂因子。,不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生:,背景二：1971年,Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出了MPF这一概念。非洲爪蟾卵细胞发育过程分为六个阶段、和期。前四个时期为卵母细胞生成和生长阶段。其中 第期时细胞核较大，称为生发泡(germinal vesicle,GV),此时细胞就停留在该时期
3、，等待成熟。,因此，在成熟卵细胞的细胞质中必然有一种物质，可以诱导卵母细胞成熟，称之为促成熟因子，MPF。进一步实验表明：在成熟卵母细胞中，MPF已经存在，只是处于非活性状态，称为前体MPF(preMPF)。非活性态的前体MPF通过翻译后修饰，可以转化为活性态的MPF。,分离纯化出MPF：,直到1988年，Maller实验室的Lohka等人才以非洲爪蟾为材料，分离得到了微克级的纯化的MPF。证明其含有p32和p45两种蛋白。二者结合后表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。证明，MPF是一种蛋白激酶。,p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系：,另一批生物学家以酵母为材料,从另一个侧
4、面对细胞周期调控进行着深入研究.如:L.Hartwell以芽殖酵母为实验材料,P.Nurse以裂殖酵母为实验材料。他们的实验原理都相同：均是在不同温度下培养酵母,获得不同的温度敏感突变体,这些不同的突变体在限定温度下，会滞留在细胞周期的某个阶段以及表现出不同的形态结构。这些与细胞分裂和周期调控有关的基因被称为(cell division cycle)cdc基因，根据被发现的先后顺序被命名。,P.Nurse在裂殖酵母中发现的cdc2基因就是第一个被分离出来的cdc基因。其表达产物是一种相对分子量为34103的蛋白，被称为p34cdc2,进一步研究发现，p34cdc2具有激酶活性，可使多种蛋白底物
5、磷酸化，在裂殖酵母周期调控中起关键性调节作用。L.Hartwell在芽殖酵母中发现的cdc28基因是第二个被分离出的cdc基因，其表达产物也是一种相对分子量为34103的蛋白，被称为p34cdc28，它也是一种蛋白激酶，在G2/M转换过程中起中心调节作用。,由此得出p34cdc2与p34cdc28是同源物。进一步研究发现：二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：p34cdc2必须与另一种蛋白p56cdc13结合后才具有激酶活性。很快MallerNurse证明：MPF中的p32可以被p34cdc2特异抗体所识别，并且p34cdc2多肽片断可以加速MPF
6、活性，表明二者是同源物。,Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。,芽殖酵母及其细胞周期,裂殖酵母及其细胞周期,在研究酵母的同时，以Tim Hunt为代表的另一批科学家正在以海胆卵为材料，对细胞周期调控进行着深入研究。他们发现：有两种蛋白质的含量随细胞周期进程的变化而变化，一般在细胞间期内积累，在细胞分裂期内消失，在下一个周期中又重复这一消长现象。因此称这两种蛋白为细胞周期蛋白(cyclin)。并很快被分离和克隆出来，证明其广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中，而且在功能上存在互补性。
7、MallerHunt合作证明：MPF中的另一种成分是周期蛋白B。序列分析证明，周期蛋白B与酵母的p56cdc13是同源物。,由此MPF的生化成分得到确定：MPF=p34cdc2+cyclinB,（催化亚单位）,（调节亚单位）,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖,周期蛋白：,自1983年首次发现周期蛋白后，许多科学家纷纷开展周期蛋白研究，短短10年就从各种生物中克隆分离了数十种周期蛋白，如酵母的Cln1、Cln2、Cln3、Clb1-Clb6，高等动物的周期蛋白A1-2、B1-
8、3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等等。各种周期蛋白均含有100个左右的保守氨基酸序列，称为周期蛋白框，它可介导周期蛋白与CDK结合。M期周期蛋白(A2,B1)分子的N端含有破坏框。G1期周期蛋白分子的C端含有一个PEST序列。,部分周期蛋白分子结构特征,图中除Cln3外，均为人的周期蛋白分子，所有这些分子均含有一个周期蛋白框。,细胞周期蛋白的破坏框与降解途径,G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有破坏框，C端有一段PEST序列与其降解有关。,部分哺乳动物和酵母细胞周期蛋白在细胞周期中的积累及其与CDK激酶活性的关系。,不同周期蛋白的表达时期不同，与不同的CDK结合，调节不同CDK激酶的活性。,谢 谢！,
